理解低內毒素回收（LER）：FDA指南到PDA TR-82深度解析
在生物制品質量控制領域，低內毒素回收（Low Endotoxin Recovery，簡稱 LER）已成為一個不容忽視的挑戰(zhàn)。它并非偶發(fā)技術問題，而是涉及配方成分、分析方法、法規(guī)要求及用藥安全的多維風險控制問題。本文基于 FDA指南與PDA技術報告No.82（TR-82），從行業(yè)技術視角解讀LER的本質、監(jiān)管要求與LER實踐路徑。
一、LER的法規(guī)背景：FDA指南與監(jiān)管邏輯
FDA雖未發(fā)布一篇專門標題為“LER指南”的獨立指導文件，但其在多個生物制品監(jiān)管文檔中，已經(jīng)將內毒素檢測中的遮蔽（Masking）、內毒素穩(wěn)定性、加標回收（Spike Recovery）保留時間（Hold-Time）研究納入監(jiān)管預期。
在2012年，F(xiàn)DA發(fā)布的 “Guidance for Industry: Pyrogens and Endotoxins Testing — Questions and Answers” 中，就明確討論了內毒素測試接受標準、方法穩(wěn)定性測試等內容。在該Q&A指南中，有一段提到樣品保存、處理、保留時間的重要性：
一、LER的法規(guī)背景：FDA指南與監(jiān)管邏輯
FDA雖未發(fā)布一篇專門標題為“LER指南”的獨立指導文件，但其在多個生物制品監(jiān)管文檔中，已經(jīng)將內毒素檢測中的遮蔽（Masking）、內毒素穩(wěn)定性、加標回收（Spike Recovery）保留時間（Hold-Time）研究納入監(jiān)管預期。
在2012年，F(xiàn)DA發(fā)布的 “Guidance for Industry: Pyrogens and Endotoxins Testing — Questions and Answers” 中，就明確討論了內毒素測試接受標準、方法穩(wěn)定性測試等內容。在該Q&A指南中，有一段提到樣品保存、處理、保留時間的重要性：
“Firms should establish procedures for storing and handling（which includes product mixing）samples for bacterial endotoxins analysis using laboratory data that demonstrate the stability of assayable endotoxins content.” 并且還提到，“sampling plan … should consider the potential … impact of in-process hold times.”
在FDA批準的案例中，當樣品配方中具有已知的掩蔽潛在因子（如聚山梨酯、EDTA、檸檬酸緩沖體系等）時，審評員會重點審查是否存在內毒素遮蔽，以及對應的緩解方案（Mitigation Strategy），是否提交了保留時間的加樣回收數(shù)據(jù)（Spike Recovery Over Time）。如未充分說明這一點，可能會要求補充資料或延長審評時間，甚至追加風險控制承諾 （Post-Approval Commitments, PAC/PMC）。 如以下的FDA BLA審評資料中，就明確提到了：
FDA BLA Review Letter / Administrative Correspondence — Janssen Biotech, Siltuximab（BLA 125496）：
FDA BLA Review Letter / Administrative Correspondence — Janssen Biotech, Siltuximab（BLA 125496）：
“The effect of hold time on endotoxin recovery should be assessed by spiking a known amount of endotoxin into undiluted drug substance and drug product and then testing for recoverable endotoxin over time. The studies should be conducted using containers of similar composition as those used for drug substance and drug product during hold.”
FDA BLA letter（BLA 761085）：
“Evaluate the effect of hold time on endotoxin detection by spiking a known amount of standard endotoxin （RSE or purified CSE） into undiluted DP and test for recoverable endotoxin over time.”
FDA letter for BLA 761430（2024年）
“Perform a supplemental low endotoxin recovery（LER） study to … examine the effects of hold time on endotoxin recovery … spiked with Reference Standard Endotoxin （RSE）… investigate additional endotoxin detection methods if LER is shown.”
FDA監(jiān)管邏輯也可解讀為：配方越復雜，尤其是生物制品，越應采用基于風險的方法 （Risk-Based Approach） 來評估內毒素檢測的穩(wěn)健性，而不是簡單依賴LAL方法的一次性驗證或適用性研究 （Method Suitability Test）。換句話說，F(xiàn)DA期望申報方展示在動態(tài)條件下（儲存、保存、稀釋、成分交互作用等）的分析體系是否可靠的“持續(xù)信心”。
目前來看，LER已不只是實驗室技術問題或“學術討論問題”，更是成為了監(jiān)管預期的一部分。FDA在審評過程中，特別是BLA階段，若配方體系中含螯合劑、表面活性劑等，審評人員可能會要求提交保留時間研究（Hold-Time Study）或加標回收率數(shù)據(jù)（Spike / Recovery Data），以證明在實際樣品中的檢測可靠性。這意味著，LER是深刻關系到產品許可審批順利與否、患者安全保障的重要環(huán)節(jié)。若我們未將LER風險納入放行體系和驗證驗證規(guī)劃（Validation Plan），將可能面臨審批延誤或審評問詢（Review Deficiency Questions, RFI）。
二、PDA技術報告No.82 （TR-82） 核心要點
為響應行業(yè)對LER風險管理的需求，PDA在2019年發(fā)布技術報告No.82，系統(tǒng)整理了LER現(xiàn)象背后的機理、推薦的保留時間研究設計方案，以及多種緩解策略的選項。TR-82 的關鍵點：
◆ 術語與定義
TR-82 提供了關于LER、遮蔽、去遮蔽（Demasking）、加標回收、保留時間的術語定義和應用解釋，幫助行業(yè)統(tǒng)一理解LER。
◆ LER保留時間研究設計原則
- 推薦設計時間點（Time Points）的選擇，例如T0（立即檢測）、多日保持（如1日/ 3日/7日/14日等）；
- 支持按時間點順序方法（Chronological Approach）或反向加標法（Reverse- Spike Method）的研究設計；
- 建議考慮樣品容器類型、溫度條件、儲存介質、加標用標準品（必須使用表征明確的內毒素標準品，如 RSE 或 CSE）；
- 強調保留時間研究雖非 USP方法驗證（Method Suitability） 的強制內容，但在BLA提交審評中日益被監(jiān)管部門要求納入補充研究中。
◆ LER 機理與影響因素
- TR-82 深入探討了導致 LER的潛在因子：螯合劑、緩沖體系pH、離子強度、溫度條件、保留時間、容器吸附效應、表面活性劑、蛋白與LPS的結合等；
- 報告強調不同來源的內毒素的敏感性不一，因此建議不要只用某一類內毒素標準品（如 NOE），應采用藥典接受的標準品（如 RSE 或 CSE）， 以保證檢測體系的可比性和接受度。
◆ 緩解/去遮蔽策略
TR-82附錄中提供多個案例，討論樣品前處理技術，去遮蔽，如加分散劑、稀釋、樣品前處理等，以及替代檢測方法，如 MAT、rFC，以解決遮蔽問題。
◆ 風險管理與監(jiān)管趨勢
TR-82鼓勵企業(yè)將LER管理納入產品生命周期的風險評估控制中，并將保留時間、去遮蔽方法學優(yōu)化納入到持續(xù)驗證 （Lifecycle Verification）中。
三、LER風險控制管理實踐建議
通過PDA TR-82與FDA指南的結合解讀，以及基于實際的申報案例，提出了LER風險評估、保留實驗規(guī)劃與緩解（去遮蔽）方法學優(yōu)化的完整框架，也成為行業(yè)技術與合規(guī)對接的重要橋梁。但到目前為止，還沒有一種能夠去除LER現(xiàn)象的標準方法或者方案，因此這可能也是FDA或者其他監(jiān)管機構沒有出“LER指南”的正式獨立指導文件的主要原因之一。
基于此，對于內毒素LER檢測，有以下幾點實踐建議：
1. 在驗證規(guī)劃階段（Validation Plan）
主動將LER風險納入風險評估（Risk Assessment），在驗證方案中明確列出保留時間研究（例如 0 h、24 h、48 h、72 h、7 d 或更長）；針對配方體系中可能含有螯合劑（EDTA、檸檬酸緩沖液）、表面活性劑（如聚山梨酯系列）、高蛋白（例如載體蛋白、輔料蛋白）等，設計專項樣品前處理（去遮蔽）組作對比研究。
2. 設計并執(zhí)行加標回收保留時間研究（Spike / Recovery & Hold-Time Study）
使用合適內毒素標準品（如 USP-認可的 RSE 或 CSE），并分別在多個時間點對樣品進行加樣與回收評估；可考慮采用按時間點順序反向或正向加標，根據(jù)時點數(shù)量與資源平衡；同時評估容器材質、溫度條件（室溫、冷藏、生產條件模擬）等對回收率的影響。
3. 若發(fā)現(xiàn)回收率顯著下降（如低于預定標準，例如50%或其他內部設定標準）
必須評估是否存在內毒素遮蔽/去遮蔽需求，建議選擇合適的前處理試劑、稀釋、加鹽或金屬離子補償、加分散劑等方法，或考慮采用商業(yè)化去遮蔽試劑（如湖州申科前處理試劑盒、去遮蔽試劑）進行優(yōu)化驗證；可將優(yōu)化后的前處理方案納入標準操作程序（SOP，并在后續(xù)批次和穩(wěn)定性樣品中持續(xù)監(jiān)控回收率（Lifecycle Verification 或 Periodic Review）。
4. 將LER風險管理前移
不應僅關注最終產品，應將保留時間、去遮蔽驗證延伸至工藝中間品、儲存條件、樣品保存、運輸、冷藏等環(huán)節(jié)，建議在生產中設置監(jiān)控點（in-process Controls），對關鍵配方工藝段或含有高風險輔料（如含高表面活性劑 /緩沖劑 /蛋白載體）工藝段納入定期加樣回收或監(jiān)測中（例如定期執(zhí)行工藝樣品的回收率檢測）。
5. 與產品申報流程對齊
若產品計劃提交國際注冊（如FDA、EMA），建議在申報資料（臨床/商業(yè)許可申請資料）中明確報告 LER保留時間研究方案、去遮蔽方法開發(fā)過程與評估結果；并將其歸入質量、CMC支持材料中，以增強審評人員對檢測方法可靠性的信心，減少審評問詢（RFI）風險。
四、總結
LER現(xiàn)象已由學術觀察逐步演變?yōu)樯镏苿┵|量控制與監(jiān)管審評中的核心關注點。基于FDA指南和監(jiān)管思路，以及PDA TR-82的技術框架，我們可以構建從風險識別、驗證設計（保留時間& 加標回收）、試劑/方法優(yōu)化（去遮蔽）、以及貫穿生產生命周期的監(jiān)控體系，主動應對LER，不僅是確保安全性與合規(guī)性需要，更是提升質量體系成熟度和監(jiān)管申報效率的重要路徑。
我們每一個負責QC、方法驗證、質量保障（QA）的團隊，都將LER管理納入其制度設計，并持續(xù)以科學數(shù)據(jù)支撐其檢測體系的穩(wěn)健性與合規(guī)性，為生成去除LER現(xiàn)象的標準方法或者方案積累大量可靠的數(shù)據(jù)。
參考文獻
TR-82附錄中提供多個案例，討論樣品前處理技術，去遮蔽，如加分散劑、稀釋、樣品前處理等，以及替代檢測方法，如 MAT、rFC，以解決遮蔽問題。
◆ 風險管理與監(jiān)管趨勢
TR-82鼓勵企業(yè)將LER管理納入產品生命周期的風險評估控制中，并將保留時間、去遮蔽方法學優(yōu)化納入到持續(xù)驗證 （Lifecycle Verification）中。
三、LER風險控制管理實踐建議
通過PDA TR-82與FDA指南的結合解讀，以及基于實際的申報案例，提出了LER風險評估、保留實驗規(guī)劃與緩解（去遮蔽）方法學優(yōu)化的完整框架，也成為行業(yè)技術與合規(guī)對接的重要橋梁。但到目前為止，還沒有一種能夠去除LER現(xiàn)象的標準方法或者方案，因此這可能也是FDA或者其他監(jiān)管機構沒有出“LER指南”的正式獨立指導文件的主要原因之一。
基于此，對于內毒素LER檢測，有以下幾點實踐建議：
1. 在驗證規(guī)劃階段（Validation Plan）
主動將LER風險納入風險評估（Risk Assessment），在驗證方案中明確列出保留時間研究（例如 0 h、24 h、48 h、72 h、7 d 或更長）；針對配方體系中可能含有螯合劑（EDTA、檸檬酸緩沖液）、表面活性劑（如聚山梨酯系列）、高蛋白（例如載體蛋白、輔料蛋白）等，設計專項樣品前處理（去遮蔽）組作對比研究。
2. 設計并執(zhí)行加標回收保留時間研究（Spike / Recovery & Hold-Time Study）
使用合適內毒素標準品（如 USP-認可的 RSE 或 CSE），并分別在多個時間點對樣品進行加樣與回收評估；可考慮采用按時間點順序反向或正向加標，根據(jù)時點數(shù)量與資源平衡；同時評估容器材質、溫度條件（室溫、冷藏、生產條件模擬）等對回收率的影響。
3. 若發(fā)現(xiàn)回收率顯著下降（如低于預定標準，例如50%或其他內部設定標準）
必須評估是否存在內毒素遮蔽/去遮蔽需求，建議選擇合適的前處理試劑、稀釋、加鹽或金屬離子補償、加分散劑等方法，或考慮采用商業(yè)化去遮蔽試劑（如湖州申科前處理試劑盒、去遮蔽試劑）進行優(yōu)化驗證；可將優(yōu)化后的前處理方案納入標準操作程序（SOP，并在后續(xù)批次和穩(wěn)定性樣品中持續(xù)監(jiān)控回收率（Lifecycle Verification 或 Periodic Review）。
4. 將LER風險管理前移
不應僅關注最終產品，應將保留時間、去遮蔽驗證延伸至工藝中間品、儲存條件、樣品保存、運輸、冷藏等環(huán)節(jié)，建議在生產中設置監(jiān)控點（in-process Controls），對關鍵配方工藝段或含有高風險輔料（如含高表面活性劑 /緩沖劑 /蛋白載體）工藝段納入定期加樣回收或監(jiān)測中（例如定期執(zhí)行工藝樣品的回收率檢測）。
5. 與產品申報流程對齊
若產品計劃提交國際注冊（如FDA、EMA），建議在申報資料（臨床/商業(yè)許可申請資料）中明確報告 LER保留時間研究方案、去遮蔽方法開發(fā)過程與評估結果；并將其歸入質量、CMC支持材料中，以增強審評人員對檢測方法可靠性的信心，減少審評問詢（RFI）風險。
四、總結
LER現(xiàn)象已由學術觀察逐步演變?yōu)樯镏苿┵|量控制與監(jiān)管審評中的核心關注點。基于FDA指南和監(jiān)管思路，以及PDA TR-82的技術框架，我們可以構建從風險識別、驗證設計（保留時間& 加標回收）、試劑/方法優(yōu)化（去遮蔽）、以及貫穿生產生命周期的監(jiān)控體系，主動應對LER，不僅是確保安全性與合規(guī)性需要，更是提升質量體系成熟度和監(jiān)管申報效率的重要路徑。
我們每一個負責QC、方法驗證、質量保障（QA）的團隊，都將LER管理納入其制度設計，并持續(xù)以科學數(shù)據(jù)支撐其檢測體系的穩(wěn)健性與合規(guī)性，為生成去除LER現(xiàn)象的標準方法或者方案積累大量可靠的數(shù)據(jù)。
參考文獻
- FDA Guidance（2012）: Low Endotoxin Recovery（LER）Phenomenon and Endotoxin Masking in Biologics
- USP <1085.1>: Use of the Bacterial Endotoxins Test for Biologics
- PDA Technical Report No. 82 （2018）: Low Endotoxin Recovery
- ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
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