高通量RNA測序（RNA-seq）的基礎原理與技術參數
高通量 RNA 測序（RNA-seq）
1. 核心基礎概念
1.1 轉錄組
轉錄組是指在特定生理或實驗條件下，單個細胞、組織或個體產生的所有轉錄產物的集合。廣義轉錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA；狹義轉錄組特指所有 mRNA 的集合，在未額外說明的實際研究中，轉錄組通常默認指代 mRNA。轉錄組可反映樣本的整體基因表達水平，因此也被稱為表達譜，常用基因芯片和 RNA-seq 技術開展研究。
Q1：廣義轉錄組與狹義轉錄組的核心區別是什么？
A1：核心區別在于包含的轉錄產物范圍，廣義轉錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA，狹義轉錄組僅包含 mRNA，實際研究中默認指代狹義轉錄組。
Q2：研究轉錄組的主要技術手段有哪些？
A2：主要技術手段包括基因芯片技術和 RNA-seq 技術，其中 RNA-seq 作為高通量測序技術，在轉錄本檢測和基因表達分析中應用廣泛。
1.2 轉錄本
所有從基因轉錄生成的 RNA 分子均稱為轉錄本。不同細胞（如肌肉細胞、神經細胞）雖含相同 DNA 序列，但因開放表達的基因不同，產生的轉錄本及后續蛋白質存在差異。轉錄本分為兩類：一類是可被核糖體翻譯為蛋白質的 mRNA；另一類是無法翻譯為蛋白質、自身具備功能的非編碼 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。
Q1：轉錄本的分類依據是什么？
A1：分類依據是能否被翻譯為蛋白質，可翻譯為蛋白質的是 mRNA，無法翻譯且自身有功能的是非編碼 RNA（ncRNA）。
Q2：不同細胞類型轉錄本存在差異的原因是什么？
A2：原因是不同細胞中開放表達的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表達的選擇性導致轉錄本種類和數量存在差異。
1.3 轉錄本產生過程
轉錄本的產生以 DNA 為模板，具體過程分為兩步：
DNA 中的基因片段先轉錄生成 pre-mRNA，該階段生成的 pre-mRNA 包含未翻譯區域（UTRs）、開放閱讀框（ORF）及內含子序列；
轉錄后加工階段，pre-mRNA 中的內含子被去除，同時在 RNA 的 5’端添加帽子結構、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最終形成可翻譯為蛋白質的成熟 mRNA 轉錄本。
其中，mRNA 的 5’帽子結構和 3’polyA 尾具有保護 RNA 免受核酸酶降解、調控轉錄后修飾、參與核轉運、影響 RNA 穩定性及翻譯效率等功能；非編碼 RNA 通常不具備這兩種結構。
Q1：pre-mRNA 加工為成熟 mRNA 的關鍵步驟是什么？
A1：關鍵步驟包括內含子去除、5’端添加帽子結構、3’端添加 polyA 尾，這三個步驟共同保障 mRNA 的功能和穩定性。
Q2：mRNA 的 5’帽子結構和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保護 mRNA 不被核酸酶降解、調控轉錄后修飾與核轉運過程、維持 mRNA 穩定性及調控翻譯效率，對 mRNA 的生物學功能至關重要。
2. RNA-seq 關鍵技術參數
2.1 測序深度（Sequencing depth）
測序深度又稱 “乘數”，是指測序過程中樣本中每個堿基被檢測到的平均次數，是衡量測序數據量的核心參數，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每個堿基被測序 100 次）。其計算邏輯為測序獲得的總有效數據量與目標基因組（或轉錄組）大小的比值。
Q1：測序深度的單位 “X” 代表什么含義？
A1：“X” 代表樣本中每個堿基被測序的平均次數，例如 50X 即表示平均每個堿基在測序中被檢測到 50 次。
Q2：計算測序深度時，分子和分母分別對應什么數據？
A2：分子是測序獲得的總有效數據量，分母是目標研究對象（如基因組或轉錄組）的總大小，兩者的比值即為測序深度。
2.2 測序覆蓋度（Coverage）
測序覆蓋度又稱 “覆蓋率”，是指測序過程中被檢測到的堿基數量占目標基因組（或轉錄組）總堿基數量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，對人類基因組（大小約 3G）測序后，若有 2.7G 堿基至少被 1 條讀段覆蓋，則測序覆蓋度為 90%（2.7G/3G×100%）。
Q1：測序覆蓋度與測序深度的核心區別是什么？
A1：測序覆蓋度反映 “被檢測到的堿基范圍占比”，用百分比表示；測序深度反映 “每個堿基被檢測的平均次數”，用 “X” 表示，兩者分別從 “范圍” 和 “次數” 描述測序效果。
Q2：若目標基因組大小為 2G，測序后有 1.8G 堿基被覆蓋，其測序覆蓋度是多少？
A2：測序覆蓋度為 90%，計算方式為被覆蓋的堿基量（1.8G）除以目標基因組大�。�2G），再乘以 100%。
2.3 reads
reads 是 RNA-seq 測序的直接結果，指測序過程中儀器檢測到的單條 RNA 序列片段，1 條獨立的序列片段即稱為 1 條 reads。這些 reads 需后續通過比對軟件與參考基因組（或轉錄組）進行匹配，才能用于基因表達量計算、轉錄本結構分析等研究。
Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始數據基礎，通過與參考基因組或轉錄組比對，可進一步分析基因表達水平、識別轉錄本結構及發現新轉錄本。
Q2：1 條 reads 是否等同于 1 個轉錄本？
A2：不等同。1 條 reads 是轉錄本的片段序列，1 個完整的轉錄本通常需要多條 reads 通過拼接或比對后才能完整呈現。
2.4 adapter（接頭序列）
adapter 是 RNA-seq 文庫構建過程中添加到 RNA 片段兩端的短序列，具有類似引物的功能。其核心作用是協助測序儀器識別并結合 RNA 片段，保障測序反應的順利啟動，測序完成后需通過生物信息學分析去除 adapter 序列，避免其對后續數據解讀產生干擾。
Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是協助測序儀器識別和結合 RNA 片段，為測序反應的啟動提供必要條件，是文庫構建和測序過程中的關鍵輔助序列。
Q2：測序完成后為何需要去除 adapter 序列？
A2：因為 adapter 是人工添加的輔助序列，并非樣本自身的 RNA 片段，若不去除會干擾基因表達量計算、轉錄本比對等后續分析，影響結果準確性。
RNA-seq 核心概念與技術參數對照表
3. 總結
RNA-seq 作為高通量測序技術，通過檢測轉錄組中的 RNA 分子，可實現基因表達水平分析、新轉錄本發現及轉錄后修飾研究。理解轉錄組、轉錄本等基礎概念，掌握測序深度、覆蓋度、reads、adapter 等關鍵技術參數，是開展 RNA-seq 研究及解讀數據結果的核心前提，為后續基因功能解析、生物過程調控機制研究提供基礎支撐。
1. 核心基礎概念
1.1 轉錄組
轉錄組是指在特定生理或實驗條件下，單個細胞、組織或個體產生的所有轉錄產物的集合。廣義轉錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA；狹義轉錄組特指所有 mRNA 的集合，在未額外說明的實際研究中，轉錄組通常默認指代 mRNA。轉錄組可反映樣本的整體基因表達水平，因此也被稱為表達譜，常用基因芯片和 RNA-seq 技術開展研究。
Q1：廣義轉錄組與狹義轉錄組的核心區別是什么？
A1：核心區別在于包含的轉錄產物范圍，廣義轉錄組涵蓋 mRNA、rRNA、tRNA 及非編碼 RNA，狹義轉錄組僅包含 mRNA，實際研究中默認指代狹義轉錄組。
Q2：研究轉錄組的主要技術手段有哪些？
A2：主要技術手段包括基因芯片技術和 RNA-seq 技術，其中 RNA-seq 作為高通量測序技術，在轉錄本檢測和基因表達分析中應用廣泛。
1.2 轉錄本
所有從基因轉錄生成的 RNA 分子均稱為轉錄本。不同細胞（如肌肉細胞、神經細胞）雖含相同 DNA 序列，但因開放表達的基因不同，產生的轉錄本及后續蛋白質存在差異。轉錄本分為兩類：一類是可被核糖體翻譯為蛋白質的 mRNA；另一類是無法翻譯為蛋白質、自身具備功能的非編碼 RNA（ncRNA），如 rRNA、tRNA、siRNA 等。
Q1：轉錄本的分類依據是什么？
A1：分類依據是能否被翻譯為蛋白質，可翻譯為蛋白質的是 mRNA，無法翻譯且自身有功能的是非編碼 RNA（ncRNA）。
Q2：不同細胞類型轉錄本存在差異的原因是什么？
A2：原因是不同細胞中開放表達的基因不同，即使 DNA 序列一致，基因表達的選擇性導致轉錄本種類和數量存在差異。
1.3 轉錄本產生過程
轉錄本的產生以 DNA 為模板，具體過程分為兩步：
DNA 中的基因片段先轉錄生成 pre-mRNA，該階段生成的 pre-mRNA 包含未翻譯區域（UTRs）、開放閱讀框（ORF）及內含子序列；
轉錄后加工階段，pre-mRNA 中的內含子被去除，同時在 RNA 的 5’端添加帽子結構、3’端添加聚腺苷酸尾巴（polyA 尾），最終形成可翻譯為蛋白質的成熟 mRNA 轉錄本。
其中，mRNA 的 5’帽子結構和 3’polyA 尾具有保護 RNA 免受核酸酶降解、調控轉錄后修飾、參與核轉運、影響 RNA 穩定性及翻譯效率等功能；非編碼 RNA 通常不具備這兩種結構。
Q1：pre-mRNA 加工為成熟 mRNA 的關鍵步驟是什么？
A1：關鍵步驟包括內含子去除、5’端添加帽子結構、3’端添加 polyA 尾，這三個步驟共同保障 mRNA 的功能和穩定性。
Q2：mRNA 的 5’帽子結構和 3’polyA 尾的核心作用是什么？
A2：核心作用包括保護 mRNA 不被核酸酶降解、調控轉錄后修飾與核轉運過程、維持 mRNA 穩定性及調控翻譯效率，對 mRNA 的生物學功能至關重要。
2. RNA-seq 關鍵技術參數
2.1 測序深度（Sequencing depth）
測序深度又稱 “乘數”，是指測序過程中樣本中每個堿基被檢測到的平均次數，是衡量測序數據量的核心參數，通常用 “X” 表示（如 100X 代表平均每個堿基被測序 100 次）。其計算邏輯為測序獲得的總有效數據量與目標基因組（或轉錄組）大小的比值。
Q1：測序深度的單位 “X” 代表什么含義？
A1：“X” 代表樣本中每個堿基被測序的平均次數，例如 50X 即表示平均每個堿基在測序中被檢測到 50 次。
Q2：計算測序深度時，分子和分母分別對應什么數據？
A2：分子是測序獲得的總有效數據量，分母是目標研究對象（如基因組或轉錄組）的總大小，兩者的比值即為測序深度。
2.2 測序覆蓋度（Coverage）
測序覆蓋度又稱 “覆蓋率”，是指測序過程中被檢測到的堿基數量占目標基因組（或轉錄組）總堿基數量的比率，通常用百分比（%）表示。例如，對人類基因組（大小約 3G）測序后，若有 2.7G 堿基至少被 1 條讀段覆蓋，則測序覆蓋度為 90%（2.7G/3G×100%）。
Q1：測序覆蓋度與測序深度的核心區別是什么？
A1：測序覆蓋度反映 “被檢測到的堿基范圍占比”，用百分比表示；測序深度反映 “每個堿基被檢測的平均次數”，用 “X” 表示，兩者分別從 “范圍” 和 “次數” 描述測序效果。
Q2：若目標基因組大小為 2G，測序后有 1.8G 堿基被覆蓋，其測序覆蓋度是多少？
A2：測序覆蓋度為 90%，計算方式為被覆蓋的堿基量（1.8G）除以目標基因組大�。�2G），再乘以 100%。
2.3 reads
reads 是 RNA-seq 測序的直接結果，指測序過程中儀器檢測到的單條 RNA 序列片段，1 條獨立的序列片段即稱為 1 條 reads。這些 reads 需后續通過比對軟件與參考基因組（或轉錄組）進行匹配，才能用于基因表達量計算、轉錄本結構分析等研究。
Q1：reads 在 RNA-seq 研究中的作用是什么？
A1：reads 是 RNA-seq 的原始數據基礎，通過與參考基因組或轉錄組比對，可進一步分析基因表達水平、識別轉錄本結構及發現新轉錄本。
Q2：1 條 reads 是否等同于 1 個轉錄本？
A2：不等同。1 條 reads 是轉錄本的片段序列，1 個完整的轉錄本通常需要多條 reads 通過拼接或比對后才能完整呈現。
2.4 adapter（接頭序列）
adapter 是 RNA-seq 文庫構建過程中添加到 RNA 片段兩端的短序列，具有類似引物的功能。其核心作用是協助測序儀器識別并結合 RNA 片段，保障測序反應的順利啟動，測序完成后需通過生物信息學分析去除 adapter 序列，避免其對后續數據解讀產生干擾。
Q1：adapter 序列在 RNA-seq 中的核心功能是什么？
A1：核心功能是協助測序儀器識別和結合 RNA 片段，為測序反應的啟動提供必要條件，是文庫構建和測序過程中的關鍵輔助序列。
Q2：測序完成后為何需要去除 adapter 序列？
A2：因為 adapter 是人工添加的輔助序列，并非樣本自身的 RNA 片段，若不去除會干擾基因表達量計算、轉錄本比對等后續分析，影響結果準確性。
RNA-seq 核心概念與技術參數對照表
3. 總結
RNA-seq 作為高通量測序技術，通過檢測轉錄組中的 RNA 分子，可實現基因表達水平分析、新轉錄本發現及轉錄后修飾研究。理解轉錄組、轉錄本等基礎概念，掌握測序深度、覆蓋度、reads、adapter 等關鍵技術參數，是開展 RNA-seq 研究及解讀數據結果的核心前提，為后續基因功能解析、生物過程調控機制研究提供基礎支撐。
| 名稱 | 貨號 | 規格 |
| 轉錄組測序(RNA-seq)實驗服務 | LX-RNAseq | / |
| 轉錄組測序（RNA-seq）檢測試劑盒 | LXR-RNAseq | / |
| NEXTFLEX® Small RNA-Seq Kit v3 | NOVA-5132-05 | 8rxns |
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