靶向CD177+中性粒細(xì)胞的線粒體復(fù)合物I可緩解肺缺血再灌注損傷的研究

期刊：Cell reports. Medicine
影響因子：10.6
主要技術(shù)：scRNA-seq、Stereo-seq

導(dǎo)語
原發(fā)性移植物功能障礙（PGD）是肺移植后早期發(fā)病率和死亡率的主要原因，中性粒細(xì)胞在其炎癥病理中起著核心作用。文章利用scRNA-seq和Stereo-seq等技術(shù)，研究肺缺血再灌注損傷（IRI）模型中的中性粒細(xì)胞亞型。研究發(fā)現(xiàn)CD177+中性粒細(xì)胞是一個(gè)活化的亞群，顯著促進(jìn)了肺損傷，并作為預(yù)測(cè)人類肺移植受者中重度PGD的早期生物標(biāo)志物。CD177+中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的氧化磷酸化和增加的線粒體復(fù)合體I活性，推動(dòng)炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞外陷阱的形成。通過使用復(fù)合體I抑制劑IACS-010759靶向線粒體功能，可以減少CD177+中性粒細(xì)胞的活化，并在小鼠IRI模型和大鼠左肺移植模型中減輕肺損傷。這些發(fā)現(xiàn)為CD177+中性粒細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的肺IRI炎癥提供了全面的圖景，并強(qiáng)調(diào)了其在未來早期診斷和治療干預(yù)中的潛在價(jià)值。

主要技術(shù)
scRNA-seq、Stereo-seq

研究結(jié)果
1. IRI小鼠肺組織的免疫學(xué)特征為顯著的Cd177+中性粒細(xì)胞浸潤
對(duì)10個(gè)左肺組織（6個(gè)IRI與4個(gè)假手術(shù)）進(jìn)行scRNA-seq測(cè)序，保留了43,852個(gè)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組用于后續(xù)分析（圖1B）。進(jìn)行聚類和注釋得到CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞中差異表達(dá)基因（DEGs）的數(shù)量大大超過了其他免疫細(xì)胞群體中的數(shù)量，表明在肺IRI期間存在強(qiáng)大的先天免疫激活（圖1C）。對(duì)比IRI組和假手術(shù)對(duì)照組的髓系細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)參與急性白細(xì)胞反應(yīng)的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞高表達(dá)Stat3、S100a8、S100a9等，并在IRI組中遷移至受損肺部（圖1D）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞是在再灌注后最被激活的細(xì)胞類型（圖1E）。因此，將分析重點(diǎn)放在小鼠scRNA-seq數(shù)據(jù)中被鑒定為肺相關(guān)中性粒細(xì)胞（LAN）的2973個(gè)細(xì)胞上（圖1F）。所有LAN細(xì)胞的基因表達(dá)模式劃分出5種轉(zhuǎn)錄上不同的狀態(tài)（圖1G-H）。其中，LAN3在IRI組中顯著增加（圖1I），差異表達(dá)基因（DEGs）和GO富集分析顯示LAN3參與超氧陰離子生成和細(xì)胞殺傷（圖1J）。另外，LAN3顯示出最高的顆粒評(píng)分,特異性表達(dá)與炎癥相關(guān)的基因Cd177。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明CD177可能參與了肺IRI期間中性粒細(xì)胞的激活過程。

圖 1

2. Cd177+中性粒細(xì)胞的激活是缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷的主要原因
為闡明Cd177+中性粒細(xì)胞的作用，采用Stereo-seq技術(shù)來驗(yàn)證scRNA-seq。利用分水嶺算法對(duì)核酸染色圖像進(jìn)行單細(xì)胞分割，得到了細(xì)胞的空間分布（圖2A）。接著，在免疫細(xì)胞浸潤區(qū)域發(fā)現(xiàn)Cd177轉(zhuǎn)錄本水平升高，并且特定顆粒基因（Ltf）和模式識(shí)別蛋白（Pglyrp1）的表達(dá)也有所增加（圖2B-C）。進(jìn)一步分析了Cd177+和Cd177−中性粒細(xì)胞，與scRNA-seq中的LAN3一致，Cd177+中性粒細(xì)胞與急性反應(yīng)以及白細(xì)胞介素1和腫瘤壞死因子α產(chǎn)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本富集，并且在受損的IRI肺部區(qū)域，瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）、CD177和Ly6G共定位，表明Cd177+中性粒細(xì)胞是一個(gè)功能上被激活的群體（圖2D-E）。為了系統(tǒng)地研究CD177+中性粒細(xì)胞的影響，研究人員生成了Cd177flox/flox；Ly6gCre小鼠，這種小鼠的中性粒細(xì)胞中特異性地缺失了Cd177基因。體外實(shí)驗(yàn)顯示，人類和小鼠的CD177缺失中性粒細(xì)胞均表現(xiàn)出活性氧（ROS）產(chǎn)生的減少，并且在形成中性粒細(xì)胞外陷阱（NET）方面效率較低，表現(xiàn)為雙鏈DNA（dsDNA）產(chǎn)生量減少（圖2F-G）。在肺門阻斷肺IRI模型中，Cd177flox/flox；Ly6gCre小鼠的左肺顯示出最小的損傷，保持了結(jié)構(gòu)完整性，且缺乏肺泡水腫或透明膜形成，NETs的浸潤幾乎不存在（圖2H-I）。這些結(jié)果表明，Cd177+中性粒細(xì)胞在肺IRI發(fā)病機(jī)制中起重要作用，而Cd177基因缺失可以有效減輕肺損傷并保留功能。

圖 2

3. 外周血CD177+細(xì)胞作為重度PGD的早期預(yù)測(cè)因子
為探究IRI小鼠肺部Cd177+中性粒細(xì)胞的來源，對(duì)來自血液的存活中性粒細(xì)胞（IRI組與假手術(shù)組，各3份）進(jìn)行了scRNA-seq測(cè)序。得到PBN1-4四個(gè)亞群，其中PBN3在IRI組顯著富集，表現(xiàn)為低表達(dá)成熟標(biāo)記物Cxcr4、Sell、高表達(dá)Mmp8、Sa1008、Camp等的Cd177+中性粒細(xì)胞，與LAN3群體一致（圖3A-C）。通過骨髓親和性評(píng)分、CytoTrace和Monocle3分析，發(fā)現(xiàn)PBN3和LAN3處于最少分化的狀態(tài)，表明Cd177+中性粒細(xì)胞是一種未成熟的激活細(xì)胞，可能在IRI期間從骨髓迅速釋放并被招募至肺部（圖3D-F）。

此外，研究人員評(píng)估了104名肺移植受者（LTRs）在移植前和移植后4小時(shí)的血液樣本，其中25人在移植后72小時(shí)內(nèi)發(fā)展為3級(jí)PGD。通過流式細(xì)胞術(shù)分析外周血中的CD177+中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)移植后4小時(shí)內(nèi)CD177+中性粒細(xì)胞比例的變化（ΔCD177+中性粒細(xì)胞）可作為3級(jí)PGD的早期診斷指標(biāo)。與傳統(tǒng)的中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（NLR）相比，ΔCD177+中性粒細(xì)胞在3級(jí)PGD組中顯著更高（圖3G-H），且具有更高的預(yù)測(cè)能力，邏輯回歸分析顯示其比值比為1.813，特征曲線分析也表明其具有出色的預(yù)測(cè)能力（AUC = 0.871）（圖3I）。

圖 3

4. CD177+中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出增加的復(fù)合體I形成和線粒體活性
研究人員利用單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)(scMetabolism）評(píng)估小鼠中性粒細(xì)胞的代謝途徑活性，發(fā)現(xiàn)LAN3群體在氧化磷酸化（OXPHOS）和碳水化合物代謝方面顯著富集，表明線粒體OXPHOS是Cd177+中性粒細(xì)胞激活的基礎(chǔ)（圖4A-B）。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，人類和小鼠的CD177+中性粒細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)表達(dá)升高，特別是與OXPHOS相關(guān)的通路（圖4C-D）。人類CD177+細(xì)胞中線粒體復(fù)合體I的核心亞基NDUFA11和NDUFS1水平顯著增加（圖4E）。透射電子顯微鏡和熒光染色揭示，CD177−細(xì)胞的線粒體嵴腔更窄，活性氧減少，而CD177+細(xì)胞的氧氣消耗率（OCR）更高（圖4F-4G）。PAGE和免疫印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了CD177+細(xì)胞中NDUFS1表達(dá)的顯著增加（圖4H）。共聚焦顯微鏡觀察到，CD177與整合素αMβ2（MAC-1和CD11b/CD18）相互作用可增加線粒體活性氧（圖4I）。分析CD11b相互作用組發(fā)現(xiàn)，ILK（整合素連接激酶）是關(guān)鍵因素，可能通過激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體I基因轉(zhuǎn)錄。共聚焦顯微鏡和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，CD177+細(xì)胞中CD11b與ILK的相互作用更強(qiáng)（圖4-K），且ILK與AKT存在顯著相互作用并伴隨AKT和mTOR的磷酸化（圖4L）。使用ILK、AKT和mTOR的抑制劑和激動(dòng)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ILK-AKT-mTOR軸是驅(qū)動(dòng)CD177+細(xì)胞中線粒體復(fù)合體I激活的關(guān)鍵途徑。抑制這些信號(hào)分子可降低CD177+細(xì)胞中NDUFS1的表達(dá)和OXPHOS活性，而激活則產(chǎn)生相反效果（圖4G-L）。這些結(jié)果揭示了CD177/MAC-1復(fù)合體通過ILK激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)CD177+中性粒細(xì)胞中的OXPHOS。

圖 4

5. 高效和選擇性復(fù)合物I抑制劑IACS- 010759減輕小鼠IRI癥狀
研究人員評(píng)估了線粒體復(fù)合體I抑制劑IACS對(duì)CD177+中性粒細(xì)胞的抗炎效果。結(jié)果顯示， 20和50 nmol/L 的IACS顯著降低了人類CD177+中性粒細(xì)胞的氧氣消耗率（OCR）（圖5A），并且降低了ROS、NET形成以及CAMP和LTF的表達(dá)。為評(píng)估靶向OXPHOS是否能有效減輕肺IRI，C57BL/6小鼠在手術(shù)前3小時(shí)通過靜脈注射接受了1 mg/kg 的IACS，結(jié)果表明，IACS處理顯著減輕了肺損傷評(píng)分（圖5B）。為確認(rèn)系統(tǒng)性IACS給藥會(huì)影響體內(nèi)中性粒細(xì)胞的線粒體功能，研究人員對(duì)IACS處理和未處理IRI肺的中性粒細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq測(cè)序。經(jīng)過質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)整合后，研究人員獲得了11,150個(gè)Cd177+細(xì)胞（IACS組：2,363個(gè)，對(duì)照組：8,787個(gè)；圖5C）。IACS處理組中Cd177+細(xì)胞的比例顯著降低（圖5D），且OXPHOS、ETC和脫顆粒相關(guān)基因評(píng)分均有所降低（圖5E）。表明IACS可以在體內(nèi)外抑制Cd177+中性粒細(xì)胞的激活。此外，研究人員采用原位左肺移植大鼠模型來模擬長時(shí)間冷缺血再灌注損傷。左供肺在4℃下保存18小時(shí)后移植，再灌注2小時(shí)后取出移植肺（圖5F）。接受IACS治療的受體大鼠顯示出損傷減輕和肺泡結(jié)構(gòu)得以保留（圖5G），且浸潤性中性粒細(xì)胞和NETs更少（圖5H）。IACS還保護(hù)肺部免受再灌注后肺水腫的影響，改善肺順應(yīng)性，降低阻力，并增強(qiáng)氧合（圖5I）。這些結(jié)果表明，通過抑制線粒體復(fù)合體I來靶向氧化磷酸化是一種緩解肺缺血再灌注損傷的可行治療策略。

圖 5

結(jié)語
本研究聚焦于CD177+中性粒細(xì)胞在肺缺血再灌注損傷（IRI）中的作用。發(fā)現(xiàn)其炎癥基因表達(dá)增加和NETs形成與IRI密切相關(guān)。CD177/MAC-1復(fù)合體通過激活A(yù)KT/mTOR軸，增加線粒體復(fù)合體I表達(dá)，促進(jìn)OXPHOS。使用復(fù)合體I抑制劑IACS在小鼠和大鼠模型中減輕了肺損傷。此外，移植后4小時(shí)受者血液中的CD177+中性粒細(xì)胞可作為3級(jí)PGD的潛在生物標(biāo)志物。研究還揭示了CD177+中性粒細(xì)胞在多種無菌性炎癥狀態(tài)下的擴(kuò)增現(xiàn)象。盡管CD177+中性粒細(xì)胞的擴(kuò)增與多種疾病的發(fā)生和嚴(yán)重程度相關(guān)，但其作為治療靶點(diǎn)的潛力尚未被充分挖掘。研究結(jié)果表明，靶向OXPHOS可能是一種有效的治療策略，但需要進(jìn)一步研究以減少潛在的不良影響。

參考文獻(xiàn)：
Wu J, Gao P, Yang C, et al.Targeting mitochondrial complex I of CD177+ neutrophils alleviates lung ischemia-reperfusion injury. Cell Rep Med. 2025 May 20;6(5):102140. doi: 10.1016/j.xcrm.2025.102140 . PMID: 40398393; PMCID: PMC12147905.