TR-FRET/FRET實驗常見問題和解決方案及其在藥物研發中的應用

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉移）實驗是一種基于兩個熒光分子之間距離依賴性能量傳遞的檢測技術，常用于研究生物大分子之間的相互作用或構象變化。

TR-FRET（Time-Resolved FRET）是FRET的技術升級，通過引入時間分辨檢測（Time-Resolved Fluorescence, TRF），解決了傳統FRET中背景高、靈敏度低的問題，更適合復雜樣品和高通量實驗。

TR-FRET在藥物研發流程中的應用
一、 在藥物研發流程中的位置（從前到后）
1.靶點生物學與配體發現（Hit ID）：受體/酶配體結合或競爭結合、蛋白–蛋白相互作用(PPI)（適合可重組/可標記體系）
2.初篩（HTS）：端點型（結合/位點占有）或活性型（如磷酸化水平）板式讀數，以 Z’、S/B、CV 評估穩健性，規模化篩庫
3.命中確認（Hit Confirmation）：多重復+多點劑量反應，去除熒光體、金屬螯合、表面活性引發的假信號
4.機理與選擇性（MOA/Selectivity）：競爭/非競爭判別、變構征象、同系家族選擇性、變位點蛋白交叉驗證
5.細胞內目標占有（TE）/通路效應：細胞TR-FRET TE：帶標記的可逆探針 + 目標蛋白（天然或標簽化），量化細胞內 Kd/IC50(TE)
6.后期應用：QC放行

二、常見TR-FRET應用場景
1. 結合與占位（Biochemical / Cell-free）：供體標記靶蛋白（或抗體），受體標記示蹤配體（tracer），供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
2. 酶活/通路活性（Kinase/Phospho、Epi等）：cAMP、生物標志物或被修飾底物（如磷酸化），用Eu/Tb抗體和受體標二抗/標簽抗體形成近鄰，供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
3. PPI/復合物結合：A供體+B受體；A–B結合，供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
4. PROTAC/分子膠（Ternary Complex）：E3供體+受體標記POI，加入雙功能分子 ，組裝三元復合體，供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
5. 細胞內Target Engagement（TE）：標簽化靶蛋白（SNAP/Halo）+細胞可滲透受體標示蹤配體；內源蛋白+抗體對（一抗Tb，二抗受體，形成夾心復合物，檢測修飾/構象）。

三、 TR-FRET和其它技術的對比

四、如何快速選擇檢測方式
1、有酶標儀TR-FRET模塊，選擇TR-FRET，免洗、通量高、背景低、動態范圍寬，是ELISA的“直接升級”。
2、需要極致靈敏度，選擇化學發光/MSD更成熟，檢測背景更低，可檢測健康人的血液樣本。
3、大分子復合物或極微量樣本，選擇AlphaLISA，可與TR-FRET互補。
4、想看實時動力學，選擇SPR，只看終點/初篩HTS，選擇TR-FRET成本和通量最佳。

TR-FRET實驗常見問題解析
TR-FRET試劑盒雖然技術成熟、靈敏度高，但在實際使用中仍會出現問題。以下是問題、原因和辦法的匯總，可作為日常排錯清單直接對照。

1.信號弱 / S:B 低 /Signal Window ＜ 2
表現：受體/供體比值（Ratio = 665/620 × 10⁴）未伴隨劑量濃度而明顯變化。
可能原因
•  供受體距離/構型不佳；標記密度低或位點不合適
•  酶標儀時間門控不佳（Delay/Integration設置不匹配Eu/Tb壽命）
•  銪/鋱供體熒光標記物過期、反復凍融或受光漂白

解決方案
•  直接讀供體通道（620 nm 左右），若本身熒光低，說明供體失效，應更換
•  做陽性對照孔，驗證儀器/試劑
•  優化時間門控Delay（50–150 µs）、Integration（100–400 µs）到 Z′ 最大 的區域；固定后不要隨意變更
•  加 0.1% BSA/Casein + 0.01–0.05% Tween-20 提升穩定與抗吸附

2．信號波動大 / CV 高 / 板間漂移
可能原因
•  加樣誤差、微孔板邊緣蒸發、孵育時間漂移、溫度過高導致試劑失效
•  組件非特異吸附、聚集體干擾
•   酶標儀配置不佳，光柵類型酶標儀特異性不好
解決方案
•  使用板封膜，全程 20–22 ℃孵育，或把板子放在帶濕盒的恒溫箱
•  棄用外圈，改用 3 復孔內圈布局
•  加表面惰化（BSA/Casein）與少量表活；必要時改高親水性板材
•  選擇濾光片類型酶標儀

3．鉤狀效應（Prozone/Hook）/鐘形曲線/高濃度反而信號降
解決方案：
•  整體下調抗體濃度，定位平臺區；保持在線性上升區。
•  調整樣本濃度（比如：細胞密度/上清液濃度/組織的量等），調至未達平臺區為止

4. 平衡未達成 / 慢結合 / 無信號
解決方案：延長孵育，可過夜。

5. 特殊樣本相關
•  血清/血漿/組織裂解液：信號低時，可延長時間或增加細胞濃度。
•  化合物干擾：帶共軛芳香環、熒光素骨架的小分子常自發熒光，若 665 nm 信號隨化合物遞增，直接排除或降低濃度。

6.常見問題與快速排錯
•  信號弱/S:B（信噪比）低：提高標記密度或選擇更高量子產率受體；優化延時與積分窗。
•  漂移/批間差：固定讀數時間線（加樣→孵育→讀數），板內“錨定”滴定孔做歸一化除理。
•  化合物干擾：若665nm信號隨化合物遞增，直接排除或降低濃度。
•  非特異聚集：低鹽+無表面活性環境下易出現假抑制，可以加0.01–0.05% Tween-20/Pluronic或加入0.1% BSA/Casein封閉。Buffer中有不溶沉淀是正�，F象。

TR-FRET試劑盒推薦
Bioauxilium是一家總部位于加拿大蒙特利爾的專業研發和生產TR-FRET技術試劑公司，其研發人員在TR-FRET技術領域深耕30余年。來自加拿大,不受關稅影響,貨期穩定。Bioauxilium 在全球擁有諸多大型藥物研發公司和CRO的用戶，THUNDER™產品的卓越性能已經廣泛得到TR-FRET用戶的好評和青睞。

THUNDER™提供胞內磷酸化蛋白、總蛋白檢測，GPCR相關第二信使cAMP檢測，細胞因子及Biomarker檢測，以及適合Assay開發的標簽抗體（ToolBox抗體）試劑等。

（1）細胞因子&生物標志檢測
Human IFNγ 為例
THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的IFNγ抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中IFNγ結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與IFNγ濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

Human IFNγ檢測范圍：32 – 30,000 pg/mL

圖：Human IFNγ檢測原理，流程及標曲

（2）磷酸化蛋白檢測
THUNDER磷酸化蛋白和總蛋白檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的蛋白抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中目標蛋白結合，產生能量共振轉移FRET（615nm），進而產生665nm熒光信號，熒光信號強度與目標蛋白濃度成正比。以磷酸化ERK為例，全程僅需4.5h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

圖3. THUNDER磷酸化蛋白檢測原理示意圖

該試劑盒已通過驗證，適用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴細胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相對定量。用EGF處理HEK293細胞（50000個細胞/孔）與不同梯度濃度的EGF在室溫下孵育10分鐘。數據顯示，EGF促進ERK磷酸化。饑餓處理不同密度的H358細胞18個小時，用不同梯度濃度的RMC-4550在37℃下孵育60分鐘。數據顯示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。用不同梯度濃度的L779,450處理不同密度的MCF7細胞，在37℃下孵育30分鐘。數據顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。在不含血清的RPMI中重懸不同密度的B淋巴細胞，用不同梯度濃度的L779,450在室溫下孵育30分鐘。數據顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點的磷酸化。

圖. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗證數據

FRET實驗速查與排錯指南

一、實驗設計四要點
1.熒光對選擇
•  原則：良好光譜重疊（供體發射+受體吸收）+足夠光譜分離（便于區分通道）+明亮/穩定。
•  常見思路：CFP/YFP系、mTurquoise2/Venus、mTFP1/mCitrine、GFP/mCherry、Alexa488/Alexa555/568 等染料對。

2.標記與構建
•  蛋白質FRET：連接位點、連接肽長度與柔性會影響距離/取向；盡量保留生物學功能，并做“拯救”或功能驗證。
•  體外標記：位點特異（如半胱氨酸、SNAP/CLIP、HaloTag），定量化標記度（DOL）和供受體化學計量。

3.對照與標準品
•  供體單獨、受體單獨表達/標記；
•  正對照：已知能FRET的融合構建（如Donor–linker–Acceptor）；
•  負對照：斷裂/突變型或分離構建（無FRET）；
•  若做定量，準備校正因子。

4.成像/儀器設置
•  方案A：敏化發射FRET（SE-FRET；常規熒光顯微）；
•  方案B：受體光漂白FRET（AP-FRET；漂白受體后供體增強）；
•  方案C：壽命FRET（FLIM-FRET）。
•  單分子/總內反射、流式FRET、板式讀數亦可按需求選擇。

二、常見問題與定位思路（Checklist）

1.FRET信號很弱/沒有
•  供受體距離>10 nm或取向不利 → 調整連接肽長度/柔性、改變標記位點；
•  光漂白過快/信噪低 → 降低光強、短曝光、使用更亮更穩的熒光團；
•  表達量失衡（受體過量或供體過量）→ 調整轉染量/感染MOI，做化學計量優化；
•  受體未成熟/折疊慢 → 更換熒光蛋白版本（如mTurquoise2、mNeonGreen、mScarlet等）或延長培養時間；
•  體系確實不發生相互作用 → 做陽性對照驗證。

2.假陽性/虛高
•  光譜串擾未除干凈 → 用單標樣本計算并應用到每次實驗；
•  交叉激發嚴重 → 調整濾光片/激發波長，或選更分離的熒光對；
•  背景/自發熒光高 → 做背景區扣除，選低自發熒光培養基（如Phenol Red–free）；
•  光毒/漂白導致形態變化 → 優化光劑量與采集時長。

3.細胞內定位改變導致結果不可比
•  供受體融合改變了靶蛋白定位/功能 → 加入Linker優化、做功能學補救；
•  不同處理組表達水平差異巨大 → 正規化供體強度或用FLIM。

4.批間差/復現性差
•  每次都重做單標定標；
•  固定軟件/擬合流程（保存腳本與參數），記錄增益、激發功率、曝光。

5.FLIM擬合困難
•  壽命分布復雜（多指數） → 先做相位/調制法或擬合；
•  信噪不足 → 提高采集時間或做時間分箱；
•  漏擬合儀器響應函數（IRF） → 采 IRF 或用參照樣品校正。

三、FRET技術應用
1. 生物學機制研究（細胞/分子尺度）
•  蛋白相互作用（PPI）/二聚化：Ras–Raf、NF-κB 亞基結合、受體酪氨酸激酶誘導二聚化。
•  構象變化（單分子或細胞內）：核糖開關折疊、動力蛋白步進、離子通道開關。
•   膜融合/囊泡運輸：SNARE 介導融合、病毒入侵。
•  力學張力/粘度與擁擠度：整合素/肌動蛋白張力傳感器、細胞質擁擠度探針。

2.活細胞信號傳導與代謝
•  離子/小分子動態：Ca²⁺、cAMP、cGMP、葡萄糖/乳酸探針。
•  激酶/磷酸化事件：PKA、ERK、AKT。
•  蛋白水解/翻譯后修飾：Caspase 活性、SUMO/Ub 相關構象變化。

3.核酸技術與分子診斷
•   qPCR 探針：SNP 分型、病原體定量
•   原位雜交（FRET-FISH）/核酸折疊：基因定位、二級結構動力學

4.高通量藥篩 & 結合測定
•  TR-FRET（時間分辨 FRET）/HTRF：受體–配體結合、蛋白–蛋白/蛋白–核酸干預篩選

5.材料與納米尺度“分子尺”
•  聚合物/納米顆粒組裝、DNA 折紙：納米結構距離標定、能量傳遞網絡

6.免疫分析與POC（床旁）方向
•  夾心免疫 FRET/近鄰依賴：激素/藥物/生物標志物定量

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