包裝腺相關(guān)病毒（AAV）的操作流程

維真生物采用的 AAV 包裝系統(tǒng)為改良版的 AAV 無輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System），該系統(tǒng)包括載體質(zhì)粒（含有目的基因表達(dá)盒，其兩端是 AAV2 的反向末端重復(fù)序列）、包裝質(zhì)粒（反式提供具有 AAV 復(fù)制和包裝功能的蛋白 Rep 和 Cap）、輔助質(zhì)粒（含有輔助病毒 Ad5 的重要元件 E1a、E1b、 E2a、E4 等）和 1 株包裝細(xì)胞（HEK293T cell）。

1、基因克隆

獲取外源基因并將其構(gòu)建至腺相關(guān)病毒載體。

2、病毒包裝

將 攜 帶 外 源 基 因 的 重 組 質(zhì) 粒 與 輔 助 質(zhì) 粒 Ad Helper Vector 和 pAAV rep/cap Vector 共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 HEK293T ，轉(zhuǎn)染 72h 后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的重組病毒。

3、收毒

分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀，用 PEG8000 沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，裂解細(xì)胞沉淀收毒，合并從細(xì)胞沉淀和上清中得到的病毒。

4、純化濃縮

碘克沙醇法對病毒進行純化。碘克沙醇密度梯度離心，可以有效地將有感染力的病毒與空衣殼病毒及其他細(xì)胞雜質(zhì)分離開，將有感染力的病毒由 10% 富集到 90% 以上。純化完成后，再將收集到的病毒液置于超濾管中進行濃縮。

5、QC

① qPCR 法檢測病毒滴度

② PCR 法檢測病毒特異性

③ 銀染法檢測病毒純度