利用ChIP-seq及多組學分析揭示精子發生的表觀遺傳調控機制
近日，中科院分子細胞科學卓越創新中心童明漢研究員，復旦大學生物醫學研究院藍斐教授、北京大學湯富酬教授團隊共同合作，在國際學術期刊《Cell Research》上發表題為“SETD1B-mediated broad H3K4me3 controls proper temporal patterns of gene expression critical for spermatid development”科研成果。研究深入探討了精子發生（Spermatogenesis）過程中表觀遺傳調控機制，重點關注組蛋白修飾H3K4me3在調控基因表達和參與精子發生中的關鍵功能。具體而言，研究團隊通過系統的表觀基因組分析，揭示了H3K4甲基轉移酶SETD1B介導的broad H3K4me3（寬域H3K4me3）在調控精子細胞發育中關鍵基因轉錄出核和時序表達中的重要作用。此研究拓展了broad H3K4me3作為轉錄調控新路徑，挑戰了H3K4me3僅局限于狹窄啟動子區域的傳統認知。
標題：SETD1B-mediated broad H3K4me3 controls proper temporal patterns of gene expression critical for spermatid development（SETD1B介導的broad H3K4me3通過調控基因表達和轉錄時序性以調控精子細胞發育）
發表時間：2025年3月4日
發表期刊：Cell Research
影響因子：IF25.9/Q1
技術平臺：ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等
作者單位：中科院分子細胞科學卓越創新中心林震博士，復旦大學榮博文博士、呂瑞途博士為文章共同第一作者；童明漢研究員、藍斐教授、湯富酬教授和復旦大學呂瑞途博士為論文共同通訊作者
DOI：10.1038/s41422-025-01080-0
表觀遺傳編程通過精細調控關鍵基因的時序性激活與抑制來共同決定細胞在發育過程中的命運。H3K4me3作為基因激活的重要標志，其在連續發育系統中調控轉錄出核和時序性作用尚不完全清楚。本研究詳細闡述了雄性生殖細胞發育過程中的表觀基因組譜，發現圓形精子細胞由SETD1B-RFX2軸調控的數千個"broad H3K4me3“，這種修飾形式此前未被充分認識。這些與H3K27ac標記的增強子和啟動子重疊的寬域，在協調穩健轉錄和基因表達的精準時序調控中發揮關鍵作用。
具體而言，broad H3K4me3能與常規H3K4me3有效競爭轉錄機制的招募，從而維持小鼠精子發生過程中關鍵基因的表達強度與精確時序。另外，破壞這一機制會導致轉錄水平與時序精度失調，最終影響精子發生。此外，研究還揭示有絲分裂向減數分裂轉換及重組完成階段，異染色質標記（如H3K27me3和H3K9me2）分布的顯著變化，且這些變化與基因沉默密切相關。
該研究不僅揭示精子發生中高度協調的表觀遺傳調控機制，還首次明確Setd1b在形成broad H3K4me3及轉錄調控中的關鍵作用，為未來解析精子發生的分子機制提供寶貴資源。Broad H3K4me3不僅在人類圓形精子細胞階段中的存在特異性，且其在男性生育力中具有重要維持作用，這為探索表觀遺傳異常相關男性不育癥的治療策略開辟新途徑。
研究方法
實驗模型和樣本準備：
使用多種轉基因小鼠模型，包括Lin28-YFP、Vasa-mCherry、Stra8-GFP-Cre、Rfx2 KO和Setd1b-floxed小鼠。通過特定的誘導和分離方法，同步并純化11個不同精子發生階段的生精細胞（精原細胞→精母細胞→圓形精子細胞）。人類精子細胞取自健康捐贈者睪丸組織。
表觀基因組分析：
ChIP-seq：檢測7種組蛋白修飾（H3K4me3、H3K27ac、H3K9me2/3、H3K27me3、H3K36me3、H3K4me1）和Pol II/TAF3結合。
NOMe-seq（核小體占位與甲基化測序）：分析DNA甲基化與染色質可及性。
RNA-seq：關聯轉錄組與表觀修飾變化。
免疫熒光和組織學分析：
通過免疫熒光和H&E染色等技術，觀察了精子發生細胞的形態和特定蛋白的表達。
功能驗證：
基因敲除：構建生殖細胞特異性Setd1b條件性敲除（cKO）小鼠，表型分析（精子形態、運動力、生育力）。
Co-IP：驗證RFX2與SETD1B的蛋白互作。
結果圖形
（1）小鼠精子發生過程中染色質表觀基因組圖譜的系統分析
研究團隊系統地分析了小鼠精子發生過程中11個不同階段的染色質表觀基因組圖譜。通過ChIP-seq技術繪制了11個生精細胞階段H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3等多種組蛋白修飾圖譜，以及DNA甲基化和染色質可及性譜。結果顯示，這些組蛋白修飾在不同階段表現出顯著時序變化，特別是在從有絲分裂到減數分裂的轉變以及減數分裂重組完成時，這些變化與基因沉默密切相關。
通過ChromHMM分析，研究者們定義了一個包含啟動子、增強子、基因體和異染色質等15種染色質狀態的模型以注釋精子發生過程中的基因組。研究發現，不同階段的精子發生細胞表現出的染色質狀態分布具有差別，特別是在B型精原細胞和粗線期精母細胞階段，染色質狀態發生了顯著變化。
（3）異染色質標記在減數分裂過渡期的兩次主要重組
研究揭示了在精子發生過程中異染色質標記（如H3K9me2和H3K27me3）的兩次主要重組。第一次重組發生在B型精原細胞→細線期精母細胞階段，H3K9me2顯著增加，沉默有絲分裂相關基因，而H3K27me3減少。第二次重組發生在中期粗線期精母細胞階段，H3K9me2和H3K9me3減少，而H3K27me3重新建立，沉默減數分裂相關基因，激活精子發生有關基因。這些變化與基因表達的全局激活和特定基因的沉默密切相關。
b. 在小鼠精子發生11個階段的H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3 ChIP-seq peaks數量。
c-d. Metagene圖，顯示從B到Z階段表達（c）和抑制（d）基因上H3K9me2的歸一化ChIP-seq reads密度。
e. Alluvial plot（沖積圖）顯示在小鼠精子發生過程中雙價域的時序變化。圖中每條線代表一個雙價基因，顯示區域為至少在一個分析階段被分類為雙價基因的區域。
f. 箱線圖展示從A1到B階段轉換過程中H3K27me3修飾缺失的雙價基因表達水平。
g. UCSC基因組瀏覽器快照顯示A1和pL階段的一個代表性雙價基因Fzd5上的H3K4me3、H3K27me3和H3K9me2的歸一化ChIP-seq reads密度。
h. UCSC基因組瀏覽器快照顯示了在RS8和成熟精子階段，三個代表性雙價基因位點上的H3K4me3和H3K27me3的歸一化ChIP-seq reads密度，表明從RS8階段到成熟精子階段雙價狀態的保守和缺失。
（4）精子細胞中構建保守且強健的broad H3K4me3和H3K27ac域
研究發現，在精子細胞中，H3K4me3和H3K27ac形成了穩固的broad結構域，broad H3K4me3在圓形精子細胞（RS4階段）達峰值（4,090個），覆蓋啟動子（59.5%）和遠端增強子（40.5%），表明這些域在精子細胞發育過程中起著關鍵作用。這些域與高表達基因相關，且在人類精子細胞中也保守存在。broad H3K4me3域與增強子和啟動子區域重疊，表明其在轉錄調控中具有重要作用。此外，通過ROSE程序分析，研究者們發現這些broad H3K4me3域與超級增強子（SE）有顯著重疊，表明其在精子細胞發育中具有重要的轉錄調控功能。
broad H3K4me3域與精子細胞身份相關的高表達基因相關聯。這些基因在精子細胞發育過程中表現出階段特異性表達模式，并且富集在與轉錄因子RFX2和CREM的結合位點。這些發現表明，broad H3K4me3域在精子細胞發育中起著關鍵的轉錄調控作用。
b. 利用GREAT對小鼠精子細胞中broad H3K4me3標記基因進行功能富集分析，以推斷潛在的功能通路和相關生物學過程。
c-d. 熱圖展示在整個小鼠精子發生過程中，RS broad H3K4me3標記基因的RNA表達水平（c）和broad H3K4me3修飾水平（d）。
e. 小鼠RSs中broad H3K4me3域內富集的轉錄因子結合motif。
f. RSs三個類別中增強子RNA表達水平箱線圖：與SEs重疊的broad H3K4me3域（BroadSE+）、不與SEs重疊的broad H3K4me3域（BroadSE–）以及典型增強子（Ens）。
g. 人類RSs中broad H3K4me3域內富集的轉錄因子結合motif。
（6）SETD1B介導broad H3K4me3域形成
研究發現，SETD1B甲基轉移酶是形成精子細胞broad H3K4me3域的主要酶。在Setd1b基因敲除小鼠（Setd1b cKO）中，broad H3K4me3域幾乎完全消失，而常規H3K4me3信號保持不變（遠端增強子區完全丟失，啟動子區保留常規H3K4me3）。表明SETD1B在精子細胞發育中具有不可替代的作用。
圖5：SETD1B負責精子發生過程中broad H3K4me3域的建立。
SETD1B通過調控Pol II在broad H3K4me3域和常規H3K4me3域之間的分布來激活精子細胞發育所需的基因。在Setd1b基因敲除小鼠中，Pol II從broad H3K4me3域重定位到到常規H3K4me3域，導致相關基因表達下調。
圖6：SETD1B缺失導致PolII重新分布和轉錄失調。
Setd1b敲除導致“早期”基因延遲表達（如Atp1a4）、“晚期”基因提前激活（如Tnp1）。結果表明在Setd1b基因敲除小鼠中，階段特異性基因的表達時序被打亂，導致精子細胞發育受損。
研究發現，RFX2能夠結合SETD1B，并且在Rfx2基因敲除小鼠中，broad H3K4me3域顯著減少。結果表明RFX2與SETD1B互作，共同構建精子細胞發育過程中的broad H3K4me3域。
此外，Setd1b基因敲除小鼠表現出精子形態異常、精子數量減少和運動能力下降，最終導致不育。表明SETD1B和broad H3K4me3的破壞導致男性不育和精子發生異常。
結論和啟示
本研究通過系統的表觀基因組分析，揭示了SETD1B在精子發生中的關鍵作用。研究結果強調了表觀遺傳調控在精子發生中的重要性，并為未來的研究提供了新的方向。特別是ChIP-seq技術在揭示組蛋白修飾時序變化和基因表達調控中的重要作用，為類似的研究提供了寶貴的經驗和方法。
參考文獻：
Lin Z, Rong B, Lyu R, Zheng Y, Chen Y, Yan J, Wu M, Gao X, Tang F, Lan F, Tong MH. SETD1B-mediated broad H3K4me3 controls proper temporal patterns of gene expression critical for spermatid development. Cell Res. 2025 Mar 4. doi: 10.1038/s41422-025-01080-0.
標題：SETD1B-mediated broad H3K4me3 controls proper temporal patterns of gene expression critical for spermatid development（SETD1B介導的broad H3K4me3通過調控基因表達和轉錄時序性以調控精子細胞發育）
發表時間：2025年3月4日
發表期刊：Cell Research
影響因子：IF25.9/Q1
技術平臺：ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等
作者單位：中科院分子細胞科學卓越創新中心林震博士，復旦大學榮博文博士、呂瑞途博士為文章共同第一作者；童明漢研究員、藍斐教授、湯富酬教授和復旦大學呂瑞途博士為論文共同通訊作者
DOI：10.1038/s41422-025-01080-0
表觀遺傳編程通過精細調控關鍵基因的時序性激活與抑制來共同決定細胞在發育過程中的命運。H3K4me3作為基因激活的重要標志，其在連續發育系統中調控轉錄出核和時序性作用尚不完全清楚。本研究詳細闡述了雄性生殖細胞發育過程中的表觀基因組譜，發現圓形精子細胞由SETD1B-RFX2軸調控的數千個"broad H3K4me3“，這種修飾形式此前未被充分認識。這些與H3K27ac標記的增強子和啟動子重疊的寬域，在協調穩健轉錄和基因表達的精準時序調控中發揮關鍵作用。
具體而言，broad H3K4me3能與常規H3K4me3有效競爭轉錄機制的招募，從而維持小鼠精子發生過程中關鍵基因的表達強度與精確時序。另外，破壞這一機制會導致轉錄水平與時序精度失調，最終影響精子發生。此外，研究還揭示有絲分裂向減數分裂轉換及重組完成階段，異染色質標記（如H3K27me3和H3K9me2）分布的顯著變化，且這些變化與基因沉默密切相關。
該研究不僅揭示精子發生中高度協調的表觀遺傳調控機制，還首次明確Setd1b在形成broad H3K4me3及轉錄調控中的關鍵作用，為未來解析精子發生的分子機制提供寶貴資源。Broad H3K4me3不僅在人類圓形精子細胞階段中的存在特異性，且其在男性生育力中具有重要維持作用，這為探索表觀遺傳異常相關男性不育癥的治療策略開辟新途徑。
研究方法
實驗模型和樣本準備：
使用多種轉基因小鼠模型，包括Lin28-YFP、Vasa-mCherry、Stra8-GFP-Cre、Rfx2 KO和Setd1b-floxed小鼠。通過特定的誘導和分離方法，同步并純化11個不同精子發生階段的生精細胞（精原細胞→精母細胞→圓形精子細胞）。人類精子細胞取自健康捐贈者睪丸組織。
表觀基因組分析：
ChIP-seq：檢測7種組蛋白修飾（H3K4me3、H3K27ac、H3K9me2/3、H3K27me3、H3K36me3、H3K4me1）和Pol II/TAF3結合。
NOMe-seq（核小體占位與甲基化測序）：分析DNA甲基化與染色質可及性。
RNA-seq：關聯轉錄組與表觀修飾變化。
免疫熒光和組織學分析：
通過免疫熒光和H&E染色等技術，觀察了精子發生細胞的形態和特定蛋白的表達。
功能驗證：
基因敲除：構建生殖細胞特異性Setd1b條件性敲除（cKO）小鼠，表型分析（精子形態、運動力、生育力）。
Co-IP：驗證RFX2與SETD1B的蛋白互作。
結果圖形
（1）小鼠精子發生過程中染色質表觀基因組圖譜的系統分析
研究團隊系統地分析了小鼠精子發生過程中11個不同階段的染色質表觀基因組圖譜。通過ChIP-seq技術繪制了11個生精細胞階段H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3等多種組蛋白修飾圖譜，以及DNA甲基化和染色質可及性譜。結果顯示，這些組蛋白修飾在不同階段表現出顯著時序變化，特別是在從有絲分裂到減數分裂的轉變以及減數分裂重組完成時，這些變化與基因沉默密切相關。
圖1：小鼠精子發生過程中全面的染色質表觀基因組圖譜構建。
- 11種同步化小鼠精子發生細胞亞型示意圖。包括有絲分裂階段（Undiff：未分化精原細胞，A1：A1型精原細胞，B：B型精原細胞）、減數分裂階段（pL：前細線期精母細胞，L：細線期精母細胞，Z：偶線期精母細胞，D：雙線期精母細胞）和精子發生階段（RS2：1-2步圓形精子細胞，RS4：3-4步圓形精子細胞，RS8：7-8步圓形精子細胞）。通過ChIP-seq和NOMe-seq分別對這11種亞型的七種組蛋白標記、核小體定位和DNA甲基化進行了全基因組范圍分析。轉錄組通過RNA-seq構建。
- UCSC基因組瀏覽器快照顯示小鼠精子發生過程中B型（上圖）和RS4階段（中圖）的RNA-seq、組蛋白標記、DNA甲基化和染色質可及性，以及在Sohlh2和Ttll4基因位點的11個不同階段的H3K4me3（下圖）。
- 量化在小鼠精子發生過程中11個階段的七種組蛋白修飾的ChIP-seq peaks數量。
- Western blot分析顯示在小鼠精子發生過程中組蛋白標記的整體水平。
- 15種ChromHMM染色質狀態的組蛋白修飾的觀測概率矩陣，右側顯示每種染色質狀態的描述性標題。活躍的啟動子靠近轉錄起始位點（TSS），標記有高H3K4me3和H3K27ac。活躍的增強子富集H3K27ac和H3K4me1，位于TSS遠端。H3K36me3修飾轉錄延伸標志。異染色質區域與H3K9me2、H3K9me3或H3K27me3相關，但缺失活性。無信號（Ns）表示沒有任何組蛋白修飾。
- 在RS4階段，不同染色質狀態（啟動子和增強子）的平均染色質可及性。
- 在11個不同階段，Zbtb16、Sohlh1、Dmc1和Acr基因位點的染色質狀態概況。Pr，啟動子；En，增強子；Tr，轉錄；Hc，異染色質。
- 展示4種與啟動子相關的染色質狀態的基因組覆蓋范圍的堆疊圖。
- 雷達圖顯示不同階段（左圖）和不同染色質狀態（右圖）中可變堿基比例。
通過ChromHMM分析，研究者們定義了一個包含啟動子、增強子、基因體和異染色質等15種染色質狀態的模型以注釋精子發生過程中的基因組。研究發現，不同階段的精子發生細胞表現出的染色質狀態分布具有差別，特別是在B型精原細胞和粗線期精母細胞階段，染色質狀態發生了顯著變化。
（3）異染色質標記在減數分裂過渡期的兩次主要重組
研究揭示了在精子發生過程中異染色質標記（如H3K9me2和H3K27me3）的兩次主要重組。第一次重組發生在B型精原細胞→細線期精母細胞階段，H3K9me2顯著增加，沉默有絲分裂相關基因，而H3K27me3減少。第二次重組發生在中期粗線期精母細胞階段，H3K9me2和H3K9me3減少，而H3K27me3重新建立，沉默減數分裂相關基因，激活精子發生有關基因。這些變化與基因表達的全局激活和特定基因的沉默密切相關。
圖2：小鼠精子發生過程中抑制性組蛋白標記的時序變化。
a. UCSC基因組瀏覽器快照顯示了Oprk1和Npbwr1基因的一個代表性基因組區域中H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3的歸一化ChIP-seq reads密度。H3K9me3 peaks之間區域用淺紅色突出顯示，以指示從B到Z階段H3K9me2富集特異性增加。啟動子區域用黃色陰影突出顯示，在B到Z階段之外的各個階段被H3K27me3修飾。右側圖顯示在指定階段H3K9me2和H3K9me3模式的虛線框區域的放大視圖。SINE、LINE和LTR元件以黑色正方形表示。b. 在小鼠精子發生11個階段的H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3 ChIP-seq peaks數量。
c-d. Metagene圖，顯示從B到Z階段表達（c）和抑制（d）基因上H3K9me2的歸一化ChIP-seq reads密度。
e. Alluvial plot（沖積圖）顯示在小鼠精子發生過程中雙價域的時序變化。圖中每條線代表一個雙價基因，顯示區域為至少在一個分析階段被分類為雙價基因的區域。
f. 箱線圖展示從A1到B階段轉換過程中H3K27me3修飾缺失的雙價基因表達水平。
g. UCSC基因組瀏覽器快照顯示A1和pL階段的一個代表性雙價基因Fzd5上的H3K4me3、H3K27me3和H3K9me2的歸一化ChIP-seq reads密度。
h. UCSC基因組瀏覽器快照顯示了在RS8和成熟精子階段，三個代表性雙價基因位點上的H3K4me3和H3K27me3的歸一化ChIP-seq reads密度，表明從RS8階段到成熟精子階段雙價狀態的保守和缺失。
（4）精子細胞中構建保守且強健的broad H3K4me3和H3K27ac域
研究發現，在精子細胞中，H3K4me3和H3K27ac形成了穩固的broad結構域，broad H3K4me3在圓形精子細胞（RS4階段）達峰值（4,090個），覆蓋啟動子（59.5%）和遠端增強子（40.5%），表明這些域在精子細胞發育過程中起著關鍵作用。這些域與高表達基因相關，且在人類精子細胞中也保守存在。broad H3K4me3域與增強子和啟動子區域重疊，表明其在轉錄調控中具有重要作用。此外，通過ROSE程序分析，研究者們發現這些broad H3K4me3域與超級增強子（SE）有顯著重疊，表明其在精子細胞發育中具有重要的轉錄調控功能。
圖3：精子發生過程中broad H3K4me3和H3K27ac域的時序變化。
- UCSC基因組瀏覽器快照顯示小鼠精子發生過程中Crem基因位點的H3K4me3（紅色）和H3K27ac（藍色）的歸一化ChIP-seq reads密度。粉色陰影突出顯示區域強調RS階段Crem基因遠端（左側）和啟動子（右側）區域的兩個broad H3K4me3和H3K27ac peaks，突出H3K4me3和H3K27ac在RS階段的broad富集模式。
- 展示小鼠精子發生過程中，所有在RS階段鑒定出的broad H3K4me3或H3K27ac peaks的歸一化ChIP-seq reads密度熱圖。上圖H3K4me3（紅色），下圖H3K27ac（藍色）。
- 展示從未分化精原細胞（Undiff）到成熟精子的broad H3K4me3 peaks（上圖）數量，以及從Undiff到RS8的啟動子和遠端區域的H3K27ac peaks（下圖）數量。Broad peaks為長度＞5kb的ChIP-seq peak。啟動子區域為距離轉錄起始位點（TSS）±2kb區域，遠端區域為距離TSS超過±2kb的基因組區域。LS表示延長的精子細胞步驟10-12，sperm表示成熟精子階段。
- 展示RS4階段與一系列指示的細胞類型相比的broad H3K4me3 peaks數量堆疊圖。這些細胞類型包括多種小鼠和人類細胞系、CD4＋ T細胞和早期胚胎細胞。
- 展示人類粗線期/雙線期（P/D）和/或RS中H3K4me3（紅色，左）和H3K27ac（藍色，右）的歸一化ChIP-seq reads密度熱圖。涵蓋人類RS中鑒定出的所有broad H3K4me3或H3K27ac peaks。
- 展示小鼠RS中通過ROSE鑒定的基于H3K4me3的超級增強子（SEs）與基于H3K27ac的SEs之間的重疊維恩圖。
- 展示基于H3K4me3的SEs、基于H3K27ac的SEs和broad H3K4me3 peas之間的重疊維恩圖。
broad H3K4me3域與精子細胞身份相關的高表達基因相關聯。這些基因在精子細胞發育過程中表現出階段特異性表達模式，并且富集在與轉錄因子RFX2和CREM的結合位點。這些發現表明，broad H3K4me3域在精子細胞發育中起著關鍵的轉錄調控作用。
圖4：精子細胞特異性的broad H3K4me3域與精子發生關鍵基因的轉錄潛力相關聯。
a. 在小鼠精子發生RS4階段，與broad、sharp和對照H3K4me3峰相關聯的目標基因表達水平箱線圖。b. 利用GREAT對小鼠精子細胞中broad H3K4me3標記基因進行功能富集分析，以推斷潛在的功能通路和相關生物學過程。
c-d. 熱圖展示在整個小鼠精子發生過程中，RS broad H3K4me3標記基因的RNA表達水平（c）和broad H3K4me3修飾水平（d）。
e. 小鼠RSs中broad H3K4me3域內富集的轉錄因子結合motif。
f. RSs三個類別中增強子RNA表達水平箱線圖：與SEs重疊的broad H3K4me3域（BroadSE+）、不與SEs重疊的broad H3K4me3域（BroadSE–）以及典型增強子（Ens）。
g. 人類RSs中broad H3K4me3域內富集的轉錄因子結合motif。
（6）SETD1B介導broad H3K4me3域形成
研究發現，SETD1B甲基轉移酶是形成精子細胞broad H3K4me3域的主要酶。在Setd1b基因敲除小鼠（Setd1b cKO）中，broad H3K4me3域幾乎完全消失，而常規H3K4me3信號保持不變（遠端增強子區完全丟失，啟動子區保留常規H3K4me3）。表明SETD1B在精子細胞發育中具有不可替代的作用。
圖5：SETD1B負責精子發生過程中broad H3K4me3域的建立。
- RNA-seq檢測的小鼠精子發生11個階段中7種H3K4me3甲基轉移酶的基因表達譜折線圖。
- 成年對照組和Setd1b條件性敲除（cKO）睪丸切片的H3K4me3（紅色，上）或H3K4me1（紅色，下）的免疫熒光（IF）染色。
- 對照和Setd1b cKO小鼠的RS4階段鑒定出的broad H3K4me3和broad H3K27ac域數量條形圖。
- 在對照和Setd1b cKO小鼠的RS4階段鑒定出的所有broad H3K4me3和H3K27ac域的歸一化reads密度熱圖。根據基因組位置，broad域分為啟動子和遠端兩組。
- Metagene圖顯示在對照和Setd1b cKO小鼠的RS4階段鑒定出的啟動子（上）和遠端（下）broad H3K4me3（左）和H3K27ac（右）peak的平均ChIP-seq reads密度。右側箱線圖顯示peak寬度。
- UCSC基因組瀏覽器快照顯示在對照和Setd1b cKO小鼠的RS4階段，Rpl22位點（常規H3K4me3峰）、Chd5位點（啟動子broad H3K4me3峰）和Tdrd7位點（常規和遠端broad H3K4me3峰）的H3K4me3和H3K27ac的歸一化ChIP-seq reads密度。
SETD1B通過調控Pol II在broad H3K4me3域和常規H3K4me3域之間的分布來激活精子細胞發育所需的基因。在Setd1b基因敲除小鼠中，Pol II從broad H3K4me3域重定位到到常規H3K4me3域，導致相關基因表達下調。
圖6：SETD1B缺失導致PolII重新分布和轉錄失調。
- UCSC基因組瀏覽器快照顯示在不同階段的RSs中H3K4me3的歸一化ChIP-seq reads密度，以及野生型對照和Setd1b條件性敲除（cKO）的RS樣本中TAF3和RNA聚合酶II的reads密度，覆蓋了Catsper1（broad H3K4me3靶標）和Nectin2（常規H3K4me3靶標）基因位點。藍色陰影突出broad H3K4me3（左圖）和常規H3K4me3（右圖）峰的區域。
- 在Setd1b耗盡后broad H3K4me3（上圖）或常規H3K4me3（下圖）標記基因的啟動子區域RNA聚合酶II富集變化的MA圖。
- 在1341個broad H3K4me3標記基因中PolII占據減少（loss）和487個常規H3K4me3標記基因中PolII占據增加（gain）的RNA聚合酶II和TAF3富集變化熱圖。左側描繪了這些區域在野生型RSs中相應的H3K4me3富集模式。
- 在比較Setd1b cKO和對照組的RS樣本時，broad H3K4me3標記基因（上圖）和常規H3K4me3標記基因（下圖）的差異基因表達火山圖。
- 在比較Setd1b cKO和對照組的RS樣本時，下調的broad H3K4me3標記基因和上調的常規H3K4me3標記基因的歸一化ChIP-seq reads密度的Metagene分析圖。
- 在比較Setd1b cKO和對照組小鼠的RS樣本時，下調和上調基因的GO分析。
- SETD1B介導的broad H3K4me3通過促進PolII占據來調控基因表達的模型。
Setd1b敲除導致“早期”基因延遲表達（如Atp1a4）、“晚期”基因提前激活（如Tnp1）。結果表明在Setd1b基因敲除小鼠中，階段特異性基因的表達時序被打亂，導致精子細胞發育受損。
圖7：SETD1B介導的broad H3K4me3確保階段特異性基因的準確表達時序和精子細胞發育。
- 折線圖描繪在對照組和Setd1b條件性敲除（cKO）小鼠的RS4、RS8和LS階段被broad H3K4me3標記的代表性早期基因（左圖）和晚期基因（右圖）的時序表達。
- UCSC基因組瀏覽器快照顯示野生型小鼠的不同精子細胞階段的H3K4me3的歸一化ChIP-seq reads密度，以及野生型對照和Setd1b cKO小鼠的RS4、RS8和LS階段覆蓋Radil（早期broad H3K4me3靶標）和Decr2（晚期常規H3K4me3靶標）基因位點的歸一化RNA聚合酶II reads密度，
- 根據峰值表達時序對broad H3K4me3靶標基因進行分類：早期（RS2和RS4）與晚期（RS8和LS10）階段（左圖）。右圖顯示早期和晚期基因對應的H3K4me3 reads密度。
- 熱圖顯示在RS4、RS8和LS10階段，早期和晚期broad H3K4me3標記基因的RNA聚合酶II富集變化。
- 熱圖顯示在RS4、RS8和LS10階段，早期和晚期broad H3K4me3標記基因的基因表達變化。
- 多折線圖顯示在RS4、RS8和LS10階段，早期和晚期broad H3K4me3標記基因的基因表達變化。
- SETD1B介導的broad H3K4me3在精子發生過程中調控階段特異性時序基因表達模型。
- 8周齡對照組和Setd1b cKO小鼠的睪丸（上圖）或附睪（下圖）切片的H&E染色。
- 成年對照組和Setd1b cKO小鼠的附睪尾部精子的數量、總數和前向運動能力。
- 用熒光染料標記的花生凝集素（PNA，紅色）對頂體進行染色，用MitoTrackerGreenFM（綠色）對線粒體進行染色，以及用DAPI（藍色）對對照組和Setd1b cKO突變體的附睪尾部精子分別進行熒光染色（左圖）。堆疊柱狀圖顯示對照組和Setd1b cKO小鼠的精子正常或異常頭部形態比例（右圖）。
研究發現，RFX2能夠結合SETD1B，并且在Rfx2基因敲除小鼠中，broad H3K4me3域顯著減少。結果表明RFX2與SETD1B互作，共同構建精子細胞發育過程中的broad H3K4me3域。
此外，Setd1b基因敲除小鼠表現出精子形態異常、精子數量減少和運動能力下降，最終導致不育。表明SETD1B和broad H3K4me3的破壞導致男性不育和精子發生異常。
結論和啟示
本研究通過系統的表觀基因組分析，揭示了SETD1B在精子發生中的關鍵作用。研究結果強調了表觀遺傳調控在精子發生中的重要性，并為未來的研究提供了新的方向。特別是ChIP-seq技術在揭示組蛋白修飾時序變化和基因表達調控中的重要作用，為類似的研究提供了寶貴的經驗和方法。
參考文獻：
Lin Z, Rong B, Lyu R, Zheng Y, Chen Y, Yan J, Wu M, Gao X, Tang F, Lan F, Tong MH. SETD1B-mediated broad H3K4me3 controls proper temporal patterns of gene expression critical for spermatid development. Cell Res. 2025 Mar 4. doi: 10.1038/s41422-025-01080-0.
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