PI3K之P85蛋白的WB檢測結(jié)果常見問題及解決方法
說起磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks），大家都不陌生，大量研究表明其是癌癥、血栓形成、炎癥及免疫性疾病的重要治療靶點(diǎn)[1]。尤其是p85/p-p85蛋白，更是多種通路研究繞不開的熱點(diǎn)。然而科研的成功不會(huì)像山坡上的蒲公英那樣唾手可得，在進(jìn)行WB檢測p85/p-p85時(shí)，時(shí)常會(huì)遇到一些棘手的問題讓人苦惱不已。今天小優(yōu)細(xì)節(jié)君就來和大家聊一聊p85/p-p85檢測的二三事。
PI3Ks是一個(gè)脂質(zhì)激酶家族，可以通過磷酸化細(xì)胞內(nèi)肌醇脂質(zhì)來調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)小泡運(yùn)輸。哺乳動(dòng)物有八種PI3K亞型，分為三類。I類PI3Ks產(chǎn)生3-磷酸肌醇脂質(zhì)，其直接激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。除了在癌癥中經(jīng)常被基因激活外，在人類非惡性過度生長綜合征和易患淋巴瘤的原發(fā)性免疫疾病中也發(fā)現(xiàn)了I類PI3K的類似突變。II類和III類PI3K是內(nèi)吞途徑、內(nèi)體循環(huán)和自噬中膜交通的調(diào)節(jié)因子，通常對細(xì)胞信號傳導(dǎo)具有間接影響[2]。目前I類PI3Ks的研究最為廣泛。
I類PI3K是p110催化亞基與調(diào)控亞基復(fù)合的異二聚體，根據(jù)調(diào)節(jié)亞基的差異，I類PI3K被細(xì)分為IA類和IB類酶。其中IA類酶包括催化亞基（p110α、p110β和p110δ）與p85調(diào)節(jié)亞基，哺乳動(dòng)物有三個(gè)編碼p85亞基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1編碼p85α、p55α、p50α，這是由于可變剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3則分別編碼p85β和p55γ。這些亞型中，p85α和p85β多肽在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)，而其他亞型的表達(dá)則有限[3]。
IA類PI3K催化亞基與調(diào)節(jié)亞基復(fù)合形成的p85–p110異二聚體在胞質(zhì)中保持無活性的狀態(tài)。通過p85的SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化蛋白（如受體酪氨酸激酶）或其他膜結(jié)合蛋白（如胰島素受體底物蛋白）的結(jié)合，被募集到質(zhì)膜。這種募集可以使p85–p110二聚體去抑制，并與胞膜中的脂質(zhì)底物結(jié)合。一項(xiàng)研究通過質(zhì)譜方法和具有內(nèi)源性標(biāo)記IA類亞基的小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明，p85α和p85β與p110α和p110β等效結(jié)合，而p85α優(yōu)先與p110δ相互作用。同時(shí)，該研究還為存在不與p110結(jié)合的獨(dú)立p85亞基提供了證據(jù)[4]。一些研究還表明p55蛋白與成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣釋放相關(guān)[5]，還可參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[6]，并且一些給藥處理可能使其與p85表現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢[7]。
經(jīng)過前面的介紹，相信大家已經(jīng)對p85/p-p85蛋白的相關(guān)信息和研究有了進(jìn)一步的了解，在此基礎(chǔ)上，我們也一起來看看，關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)中p85/p-p85蛋白檢測時(shí)可能會(huì)遇到的一些問題和排查的方法。
在我們檢測p85/p-p85條帶時(shí)，常會(huì)遇到這樣的結(jié)果，得到的條帶中既有85KD的蛋白條帶，也有55KD附近的條帶。根據(jù)前文我們可以知道，這很可能是由于可變剪切造成的，我們可以先查閱文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫如uniprot等，輔助判斷一下樣本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是檢測p-p85，可以結(jié)合p85的結(jié)果綜合判斷，如兩組檢測結(jié)果均存在50KD附近的條帶，可以認(rèn)為是可變剪切的蛋白條帶。如果想要進(jìn)一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本以及設(shè)計(jì)敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
除去上述檢測到多條帶的情況，還有時(shí)會(huì)出現(xiàn)僅檢測到55KD條帶的情況，多發(fā)生在p-p85蛋白的檢測中，這種情況下首先可以嘗試遮擋50KD處進(jìn)行曝光，看下85KD處是否可以顯出條帶，避免因50KD處信號條帶過強(qiáng)，顯影時(shí)掩蓋了85KD處的信號；其次，在下圖中，我們可以看到，檢測p85時(shí)，85KD和50KD附近均有清晰且明顯的條帶，推測50KD附近條帶時(shí)可變剪切體的磷酸化條帶。這時(shí)，還可以使用去磷酸化的堿性磷酸酶對轉(zhuǎn)印后的膜進(jìn)行處理，或使用λ磷酸酶處理樣本再進(jìn)行檢測，看下50KD處條帶是否依然存在，如處理后條帶消失，說明其是磷酸化的剪切體。另外，這種情況也可以通過更換樣本進(jìn)行檢測輔助判斷。
在常見的多條帶和條帶位置與預(yù)期不符以外，還可能會(huì)出現(xiàn)無條帶的情況，這時(shí)我們可以先查詢文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫，如HPA、BioGPS等初步判斷一下p85在樣本中的表達(dá)水平如何。如樣本中靶標(biāo)蛋白的表達(dá)量偏低，可以在提取蛋白時(shí)進(jìn)行超聲處理，提高蛋白提取效率，并適當(dāng)提高蛋白上樣量。也可以使用一些高表達(dá)的樣本同時(shí)進(jìn)行WB檢測，排查是否是樣本原因?qū)е铝藷o信號的結(jié)果，還可以更換免疫位點(diǎn)不同的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，排查無信號的具體原因，從而解決問題。
另外由于p85蛋白存在可變剪切體的形式，在初次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議保留完整的膜進(jìn)行檢測，先確定樣本中目的蛋白的具體分子量，避免因裁膜范圍不當(dāng)，導(dǎo)致目的蛋白丟失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
PI3Ks是一個(gè)脂質(zhì)激酶家族，可以通過磷酸化細(xì)胞內(nèi)肌醇脂質(zhì)來調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)小泡運(yùn)輸。哺乳動(dòng)物有八種PI3K亞型，分為三類。I類PI3Ks產(chǎn)生3-磷酸肌醇脂質(zhì)，其直接激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。除了在癌癥中經(jīng)常被基因激活外，在人類非惡性過度生長綜合征和易患淋巴瘤的原發(fā)性免疫疾病中也發(fā)現(xiàn)了I類PI3K的類似突變。II類和III類PI3K是內(nèi)吞途徑、內(nèi)體循環(huán)和自噬中膜交通的調(diào)節(jié)因子，通常對細(xì)胞信號傳導(dǎo)具有間接影響[2]。目前I類PI3Ks的研究最為廣泛。
I類PI3K是p110催化亞基與調(diào)控亞基復(fù)合的異二聚體，根據(jù)調(diào)節(jié)亞基的差異，I類PI3K被細(xì)分為IA類和IB類酶。其中IA類酶包括催化亞基（p110α、p110β和p110δ）與p85調(diào)節(jié)亞基，哺乳動(dòng)物有三個(gè)編碼p85亞基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1編碼p85α、p55α、p50α，這是由于可變剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3則分別編碼p85β和p55γ。這些亞型中，p85α和p85β多肽在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)，而其他亞型的表達(dá)則有限[3]。
Fig.1 I類PI3K的IA類結(jié)構(gòu)示意圖
IA類PI3K催化亞基與調(diào)節(jié)亞基復(fù)合形成的p85–p110異二聚體在胞質(zhì)中保持無活性的狀態(tài)。通過p85的SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化蛋白（如受體酪氨酸激酶）或其他膜結(jié)合蛋白（如胰島素受體底物蛋白）的結(jié)合，被募集到質(zhì)膜。這種募集可以使p85–p110二聚體去抑制，并與胞膜中的脂質(zhì)底物結(jié)合。一項(xiàng)研究通過質(zhì)譜方法和具有內(nèi)源性標(biāo)記IA類亞基的小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明，p85α和p85β與p110α和p110β等效結(jié)合，而p85α優(yōu)先與p110δ相互作用。同時(shí)，該研究還為存在不與p110結(jié)合的獨(dú)立p85亞基提供了證據(jù)[4]。一些研究還表明p55蛋白與成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣釋放相關(guān)[5]，還可參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[6]，并且一些給藥處理可能使其與p85表現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢[7]。
經(jīng)過前面的介紹，相信大家已經(jīng)對p85/p-p85蛋白的相關(guān)信息和研究有了進(jìn)一步的了解，在此基礎(chǔ)上，我們也一起來看看，關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)中p85/p-p85蛋白檢測時(shí)可能會(huì)遇到的一些問題和排查的方法。
在我們檢測p85/p-p85條帶時(shí)，常會(huì)遇到這樣的結(jié)果，得到的條帶中既有85KD的蛋白條帶，也有55KD附近的條帶。根據(jù)前文我們可以知道，這很可能是由于可變剪切造成的，我們可以先查閱文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫如uniprot等，輔助判斷一下樣本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是檢測p-p85，可以結(jié)合p85的結(jié)果綜合判斷，如兩組檢測結(jié)果均存在50KD附近的條帶，可以認(rèn)為是可變剪切的蛋白條帶。如果想要進(jìn)一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本以及設(shè)計(jì)敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
除去上述檢測到多條帶的情況，還有時(shí)會(huì)出現(xiàn)僅檢測到55KD條帶的情況，多發(fā)生在p-p85蛋白的檢測中，這種情況下首先可以嘗試遮擋50KD處進(jìn)行曝光，看下85KD處是否可以顯出條帶，避免因50KD處信號條帶過強(qiáng)，顯影時(shí)掩蓋了85KD處的信號；其次，在下圖中，我們可以看到，檢測p85時(shí)，85KD和50KD附近均有清晰且明顯的條帶，推測50KD附近條帶時(shí)可變剪切體的磷酸化條帶。這時(shí)，還可以使用去磷酸化的堿性磷酸酶對轉(zhuǎn)印后的膜進(jìn)行處理，或使用λ磷酸酶處理樣本再進(jìn)行檢測，看下50KD處條帶是否依然存在，如處理后條帶消失，說明其是磷酸化的剪切體。另外，這種情況也可以通過更換樣本進(jìn)行檢測輔助判斷。
在常見的多條帶和條帶位置與預(yù)期不符以外，還可能會(huì)出現(xiàn)無條帶的情況，這時(shí)我們可以先查詢文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫，如HPA、BioGPS等初步判斷一下p85在樣本中的表達(dá)水平如何。如樣本中靶標(biāo)蛋白的表達(dá)量偏低，可以在提取蛋白時(shí)進(jìn)行超聲處理，提高蛋白提取效率，并適當(dāng)提高蛋白上樣量。也可以使用一些高表達(dá)的樣本同時(shí)進(jìn)行WB檢測，排查是否是樣本原因?qū)е铝藷o信號的結(jié)果，還可以更換免疫位點(diǎn)不同的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，排查無信號的具體原因，從而解決問題。
另外由于p85蛋白存在可變剪切體的形式，在初次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議保留完整的膜進(jìn)行檢測，先確定樣本中目的蛋白的具體分子量，避免因裁膜范圍不當(dāng)，導(dǎo)致目的蛋白丟失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
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PI3 Kinase p85 Antibody |
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PI3 Kinase p85(19H8) Rabbit mAb |
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Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)p55 (Tyr199) Antibody |
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Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)p55 (Tyr199)(E3U1H) Rabbit mAb |
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PI3 Kinase p55 (D2B3) Rabbit mAb |
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Rabbit anti-PI3 Kinase p85 Monoclonal Antibody |
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Rabbit anti-PI3 Kinase p85 Recombinant Monoclonal Antibody(R108) |
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Rabbit anti-Phospho-PI3-kinase p85-α(Tyr607) Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-PI3K p85 α(pY467/199) Polyclonal Antibody |
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Mouse anti-PI 3 Kinase p85α Monoclonal Antibody |
參考文獻(xiàn)：
[1] Miller MS, Thompson PE, Gabelli SB. Structural Determinants of Isoform Selectivity in PI3K Inhibitors. Biomolecules. 2019 Feb 26;9(3):82. doi: 10.3390/biom9030082. PMID: 30813656; PMCID: PMC6468644.[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
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