SMI助力揭示Ewing肉瘤對免疫檢查點抑制劑的三重抵抗機制
一、文章背景
Ewing肉瘤（EwS）是一種好發(fā)于青少年的侵襲性骨腫瘤，盡管局灶期患者預后較好，但復發(fā)或轉移后的治療手段有限，生存率低，臨床亟需新的治療策略。免疫檢查點抑制劑（ICIs）在多種癌癥中取得成功，但在EwS中療效甚微，其機制尚不清楚。由于EwS發(fā)病率低，缺乏系統(tǒng)研究治療前后腫瘤微環(huán)境變化的樣本。本研究利用SARC028臨床試驗中罕見的治療前后配對活檢樣本，結合多重空間組學技術，系統(tǒng)揭示了EwS對PD-1單藥免疫治療抵抗的微環(huán)境機制。
二、研究設計
本研究依托SARC028臨床試驗的獨特樣本資源，系統(tǒng)分析了13位復發(fā)/難治性Ewing肉瘤（EwS）患者在免疫檢查點抑制劑pembrolizumab治療前與治療8周后的腫瘤活檢樣本。共收集到37個組織切片，構建組織芯片（TMA），開展以下分析：
- 多重免疫熒光（mIF）：定量腫瘤中不同免疫細胞亞群的浸潤程度，包括CD4⁺、CD8⁺ T細胞，F(xiàn)OXP3⁺調節(jié)性T細胞，CD68⁺巨噬細胞，CD20⁺ B細胞，及CD45⁺總免疫細胞。
- GeoMx DSP空間蛋白組：檢測68種蛋白的表達，評估免疫調節(jié)變化。總共分析 48個區(qū)域，包括：腫瘤區(qū)（依據(jù)NKX2.2+ 識別）、CD8⁺ T細胞區(qū)、CD68⁺巨噬細胞區(qū)與非陽性間質區(qū)。
- CosMx SMI空間轉錄組：通過單細胞水平的空間轉錄組圖譜，識別細胞亞群與空間鄰域。使用CosMx Human Universal Cell Characterization RNA Panel（1000-plex）
- 整合scRNA-seq數(shù)據(jù)：與已構建的EwS腫瘤微環(huán)境單細胞圖譜整合，進行細胞注釋。
本研究巧妙融合了三種空間組學技術，形成縱向-橫向聯(lián)動的分析框架：mIF用于定量免疫細胞浸潤，揭示免疫細胞總體變化；GeoMx DSP空間蛋白組學進一步解析免疫調節(jié)蛋白的空間表達狀態(tài)與治療應答的關系，提供蛋白水平的動態(tài)信息；CosMx SMI空間轉錄組則在單細胞分辨率下描繪細胞類型組成、空間鄰域結構及腫瘤亞群的功能狀態(tài)，揭示免疫抵抗的關鍵機制。
研究設計三、核心發(fā)現(xiàn)
1.Pembrolizumab未能顯著提升EwS腫瘤中免疫細胞浸潤水平
研究通過多重免疫熒光分析治療前后Ewing肉瘤腫瘤活檢樣本，評估T細胞、B細胞、巨噬細胞及調節(jié)性T細胞等免疫亞群的浸潤水平。結果顯示，pembrolizumab治療前后，腫瘤組織中CD45⁺總免疫細胞數(shù)量并無顯著變化，CD4⁺、CD8⁺、CD68⁺、FOXP3⁺等亞群數(shù)量也未見顯著波動。在個體水平上，部分患者存在免疫細胞數(shù)量升高或下降的情況，但這種變化未與治療后腫瘤體積變化顯著相關。這一結果提示，單藥抗PD-1治療難以有效激活EwS患者的抗腫瘤免疫反應，可能由于其本底免疫細胞浸潤水平低，或缺乏免疫激活所需的關鍵信號。
pembrolizumab治療不會改變EwS總免疫細胞密度2. 免疫檢查點治療誘導免疫抑制蛋白上調，提示潛在的免疫負反饋
通過GeoMx DSP空間蛋白質組技術對治療前后腫瘤組織中多個ROI區(qū)域進行蛋白表達譜分析，發(fā)現(xiàn)治療后樣本中多個免疫抑制相關蛋白顯著上調，包括CD163、FOXP3、CTLA4、IDO1、LAG3等。盡管整體蛋白表達譜未呈現(xiàn)大幅變化，仍可觀察到特定免疫調控蛋白在腫瘤或間質區(qū)增強表達的趨勢。這表明PD-1治療在EwS中可能誘導了反向免疫調節(jié)效應，增強了免疫抑制狀態(tài)。又或是加劇了TME中既有的抑制性信號，從而削弱了T細胞激活與持續(xù)效應。
空間蛋白質組分析顯示PD-1阻斷治療后免疫抑制相關蛋白表達上調3. 空間鄰域分析揭示免疫抵抗三聯(lián)征--高TGF-β、低IFN響應、低HLA-I表達
結合CosMx SMI空間轉錄組數(shù)據(jù)與整合后的scRNA-seq參考圖譜，研究構建了10種空間細胞鄰域（cellular neighborhoods, CN）。其中CN10鄰域在多個免疫治療失敗患者中反復出現(xiàn)，其主要由兩類腫瘤細胞亞群（c1與c4）構成。這些腫瘤細胞亞群具有顯著的TGF-β信號活性增強、HLA class I分子表達缺失、干擾素應答能力低下等特征。進一步分析顯示，HLA-I表達水平與免疫細胞浸潤程度及IFN信號呈正相關，且在EwS細胞系中可通過外源IFN-γ刺激恢復HLA-I表達。這提示CN10所代表的免疫抑制三聯(lián)征極可能是導致EwS原發(fā)性抗PD-1治療失敗的核心機制，同時也指出了可能的逆轉方向--靶向TGF-β、增強IFN響應與抗原呈遞通路。
空間分辨的腫瘤鄰域揭示驅動Ewing肉瘤抗PD-1治療抵抗的免疫抑制軸四、小結
這項研究提供了迄今為止最全面的Ewing肉瘤免疫微環(huán)境空間圖譜，首次明確了治療失敗后腫瘤躲避免疫的三重機制：TGFβ激活、IFN反應缺失、HLA-I表達降低。該文章也提出了幾點建議：
- 聯(lián)合療法是未來方向，例如聯(lián)合TGFβ抑制劑、放療、激活IFN通路等
- 考慮非HLA依賴的免疫策略，如CAR-T等
- 空間組學為研究罕見腫瘤療效耐藥提供新的研究路徑
- 在免疫治療臨床試驗中，動態(tài)獲取患者治療前后的腫瘤樣本是至關重要的。
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