PeCPK21與HMAPs互作增強雜交楊鎘脅迫耐受性的分子機制
2025年8月，北京林業大學林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室的研究團隊在《Environmental and Experimental Botany》發表一篇題為“PeCPK21 interacts with HMAPs to tolerate elevated cadmium stress in Populus × canescens”的研究論文。該研究借助HaloTag pull-down和質譜分析，揭示了PeCPK21作為Cd²⁺信號傳感器，通過與HMAPs互作從多維度增強楊樹耐鎘性的分子機制，為林木耐鎘基因工程提供了重要靶點。
研究背景
鎘（Cd²⁺）作為一種高毒性重金屬污染物，可通過土壤-植物系統進入食物鏈，對生態系統穩定性和人類健康構成嚴重威脅。植物修復技術因成本低、環境友好等特點，成為治理鎘污染土壤的重要手段。楊樹作為速生樹種，具有生物量大、根系與地上部分鎘吸收能力強等優勢，在鎘污染土壤修復中展現出巨大潛力。然而，高濃度鎘脅迫會對楊樹造成顯著毒性，導致葉綠體和線粒體結構畸形，抑制生長與光合作用，限制其修復效率。因此，通過基因工程手段提高楊樹的鎘耐受性成為當前研究熱點。鈣依賴蛋白激酶（CPKs）作為鈣信號傳感器，在植物應對鎘脅迫中發揮關鍵作用。擬南芥中，AtCPK21和AtCPK23通過磷酸化轉運蛋白NRAMP6限制鎘積累。前期研究發現，胡楊PeCPK21在擬南芥中可與重金屬轉運相關蛋白及轉錄因子AtNFYC3互作，通過減少鎘積累和增強抗氧化系統提高耐受性。然而，PeCPK21在楊樹中是否通過與重金屬脅迫相關蛋白（HMAPs）互作調控鎘耐受性，其具體分子機制仍不明確。
主要研究結果
1 PeCPK21提高楊樹鎘耐受性本研究選擇18個PeCPK21轉基因雜交楊品系，旨在明確其在鎘脅迫下的作用。RT-qPCR、Western blot 結果顯示OE10株系的蛋白表達量最高，OE7株系最低。隨后，作者選取OE1、OE6、OE10 這3個轉基因株系進行后續鎘耐受性檢測。在500 μM CdCl₂處理30 d后，過表達株系（OE1、OE6、OE10）株高和莖粗增量顯著高于野生型（WT），而REL（相對電導率）顯著低于WT。結果表明，PeCPK21過表達能夠增強楊樹鎘耐受性。
2 鎘對光合與蒸騰的影響
為了研究鎘對PeCPK21轉基因楊樹光合作用與蒸騰作用的影響，作者進一步檢測了光合參數（Pn、E、Cleaf），葉綠素含量及熒光指標（Fv/Fm、YII、ETR）。結果顯示，OE1、OE6、OE10 的 Pn、E、Cleaf值比野生型高17%–32%，表明PeCPK21過表達可緩解鎘脅迫對氣孔功能和碳同化的抑制；葉綠素含量及Fv/Fm、YII、ETR的下降幅度均小于野生型，表明PeCPK21可減輕鎘對光合色素和光反應系統的損傷。綜上所述，PeCPK21過表達可緩解鎘對光合系統的抑制。
3 鎘對ROS與抗氧化酶的影響
Cd2+積累促進植物細胞產生ROS。作者采用DAB和NBT染色檢測H₂O₂和O₂⁻含量，并通過試劑盒測定POD、CAT、SOD活性及相關基因表達。結果顯示，CdCl₂處理后，轉基因株系ROS積累更少，POD、CAT、SOD活性及對應基因（PcPODa2、PcCAT1等）表達量顯著高于WT，表明PeCPK21過表達能夠增強楊樹抗氧化防御能力。
4 鎘的吸收與運輸
為進一步研究鎘脅迫對Cd²⁺吸收與轉運的影響，作者采用原子吸收光譜測定根、莖、葉鎘含量，非損傷微測技術（NMT）測定根尖鎘通量。結果顯示，CdCl₂處理后，轉基因株系全株鎘積累量及各器官鎘含量顯著低于WT，根尖Cd²⁺凈流入量減少41%-51%，表明PeCPK21過表達能夠限制楊樹對鎘的吸收與轉運。
5 PeCPK21互作蛋白鑒定
為深入探究與PeCPK21互作的蛋白，作者采用HaloTag pull-down、SDS-PAGE、LC-MS/MS技術進行富集-分離-鑒定，共鑒定到四類互作蛋白：
（a）重金屬轉運相關蛋白：例如銅轉運蛋白（PcATX1）、鈣依賴蛋白激酶（PcCPK2、PcCPK23）以及木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶蛋白6（PcXTH6）；
（b）光合相關蛋白：包括高葉綠素熒光蛋白136（PcHCF136，定位于葉綠體）、光系統Ⅱ10 kDa 多肽（PcPsbR）、捕光復合體類似蛋白（PcOHP1）、光合NDH復合體腔側亞基5（PcPNSL5）、類囊體彎曲蛋白1A/1B/1C（PcCURT1A/1B/1C，定位于葉綠體）、ATP 合酶α亞基（PcatpA，定位于葉綠體）以及ATP合酶δ亞基（PcATPD，定位于葉綠體）；
（c）膜內在蛋白：如質膜內在蛋白2-5（PcPIP2-5）、液泡膜內在蛋白1-3（PcTIP1-3）和液泡膜內在蛋白2-1（PcTIP2-1）；
（d）抗氧化酶：包括鐵型超氧化物歧化酶（PcSOD[Fe]）和L-抗壞血酸過氧化物酶（PcAPX2）。
6 PeCPK21相互作用蛋白的轉錄本分析
作者采用RT-qPCR檢測了CdCl2處理后野生型（WT）和3個轉基因株系與PeCPK21相互作用的重金屬脅迫相關蛋白（HMAPs）的表達情況。結果顯示，轉基因株系中光合相關基因（PcHCF136、PcatpA）、重金屬轉運基因（PcATX1、PcCPK2、PcCPK23和PcXTH6）、抗氧化酶基因（PcAPX2、PcSOD [Fe]）、膜內在蛋白基因（PcPIP2-5、PcTIP1-3和PcTIP2-1）的表達量顯著高于WT，且這種高表達更利于楊樹應對鎘脅迫。
7 PeCPK21與PcXTH6互作及功能
作者采用HaloTag pull-down、Co-IP、LCI進一步驗證PeCPK21與PcXTH6互作，并構建過PcXTH6表達株系，測定其鎘含量、木葡聚糖降解活性（XDA）及木葡聚糖含量。結果顯示，PeCPK21與PcXTH6直接互作，過表達PcXTH6可通過提高XDA、降低木葡聚糖含量，減少細胞壁上的 Cd²⁺結合位點，從而降低楊樹對鎘的吸收與積累。
8 PeCPK21與PcSOD [Fe]互作及功能
在CdCl₂處理后下，PeCPK21轉基因楊樹維持了較高的PcSOD[Fe]表達水平，這表明PeCPK21可通過與抗氧化酶相互作用來維持ROS穩態。為明確PcSOD[Fe]在Cd²⁺脅迫下抗氧化防御中的積極作用，作者進一步構建了PcSOD[Fe]過表達株系，并測定其ROS含量及抗氧化酶活性。結果顯示，PeCPK21與PcSOD[Fe]互作，過表達PcSOD[Fe] 能顯著提高鎘脅迫下POD、CAT、SOD活性，減少ROS積累，增強楊樹的鎘耐受性。
結論
本文綜合運用基因過表達、分子互作驗證、生理與分子指標測定等方法，證實PeCPK21通過與HMAPs（重金屬轉運相關蛋白、光合相關蛋白、膜內在蛋白、抗氧化酶）相互作用，限制Cd²⁺積累、增強ROS清除能力、維持光合效率與水分平衡，從而提高歐洲山楊×銀白楊對高濃度鎘脅迫的耐受性，為木本植物鎘耐受遺傳改良提供理論依據。
藍景科信HaloTag pull-down優勢：
1、采用真核無細胞蛋白表達系統，表達蛋白可進行翻譯后修飾，更接近體內真實蛋白狀態。
2、無需轉化和鑒定，可直接表達目的蛋白，節省實驗時間。
3、蛋白表達成功率高，系統模擬真核細胞折疊環境、無活細胞內空間擁擠限制，表達產物無包涵體。
鎘（Cd²⁺）作為一種高毒性重金屬污染物，可通過土壤-植物系統進入食物鏈，對生態系統穩定性和人類健康構成嚴重威脅。植物修復技術因成本低、環境友好等特點，成為治理鎘污染土壤的重要手段。楊樹作為速生樹種，具有生物量大、根系與地上部分鎘吸收能力強等優勢，在鎘污染土壤修復中展現出巨大潛力。然而，高濃度鎘脅迫會對楊樹造成顯著毒性，導致葉綠體和線粒體結構畸形，抑制生長與光合作用，限制其修復效率。因此，通過基因工程手段提高楊樹的鎘耐受性成為當前研究熱點。鈣依賴蛋白激酶（CPKs）作為鈣信號傳感器，在植物應對鎘脅迫中發揮關鍵作用。擬南芥中，AtCPK21和AtCPK23通過磷酸化轉運蛋白NRAMP6限制鎘積累。前期研究發現，胡楊PeCPK21在擬南芥中可與重金屬轉運相關蛋白及轉錄因子AtNFYC3互作，通過減少鎘積累和增強抗氧化系統提高耐受性。然而，PeCPK21在楊樹中是否通過與重金屬脅迫相關蛋白（HMAPs）互作調控鎘耐受性，其具體分子機制仍不明確。
主要研究結果
1 PeCPK21提高楊樹鎘耐受性本研究選擇18個PeCPK21轉基因雜交楊品系，旨在明確其在鎘脅迫下的作用。RT-qPCR、Western blot 結果顯示OE10株系的蛋白表達量最高，OE7株系最低。隨后，作者選取OE1、OE6、OE10 這3個轉基因株系進行后續鎘耐受性檢測。在500 μM CdCl₂處理30 d后，過表達株系（OE1、OE6、OE10）株高和莖粗增量顯著高于野生型（WT），而REL（相對電導率）顯著低于WT。結果表明，PeCPK21過表達能夠增強楊樹鎘耐受性。
為了研究鎘對PeCPK21轉基因楊樹光合作用與蒸騰作用的影響，作者進一步檢測了光合參數（Pn、E、Cleaf），葉綠素含量及熒光指標（Fv/Fm、YII、ETR）。結果顯示，OE1、OE6、OE10 的 Pn、E、Cleaf值比野生型高17%–32%，表明PeCPK21過表達可緩解鎘脅迫對氣孔功能和碳同化的抑制；葉綠素含量及Fv/Fm、YII、ETR的下降幅度均小于野生型，表明PeCPK21可減輕鎘對光合色素和光反應系統的損傷。綜上所述，PeCPK21過表達可緩解鎘對光合系統的抑制。
Cd2+積累促進植物細胞產生ROS。作者采用DAB和NBT染色檢測H₂O₂和O₂⁻含量，并通過試劑盒測定POD、CAT、SOD活性及相關基因表達。結果顯示，CdCl₂處理后，轉基因株系ROS積累更少，POD、CAT、SOD活性及對應基因（PcPODa2、PcCAT1等）表達量顯著高于WT，表明PeCPK21過表達能夠增強楊樹抗氧化防御能力。
為進一步研究鎘脅迫對Cd²⁺吸收與轉運的影響，作者采用原子吸收光譜測定根、莖、葉鎘含量，非損傷微測技術（NMT）測定根尖鎘通量。結果顯示，CdCl₂處理后，轉基因株系全株鎘積累量及各器官鎘含量顯著低于WT，根尖Cd²⁺凈流入量減少41%-51%，表明PeCPK21過表達能夠限制楊樹對鎘的吸收與轉運。
為深入探究與PeCPK21互作的蛋白，作者采用HaloTag pull-down、SDS-PAGE、LC-MS/MS技術進行富集-分離-鑒定，共鑒定到四類互作蛋白：
（a）重金屬轉運相關蛋白：例如銅轉運蛋白（PcATX1）、鈣依賴蛋白激酶（PcCPK2、PcCPK23）以及木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶蛋白6（PcXTH6）；
（b）光合相關蛋白：包括高葉綠素熒光蛋白136（PcHCF136，定位于葉綠體）、光系統Ⅱ10 kDa 多肽（PcPsbR）、捕光復合體類似蛋白（PcOHP1）、光合NDH復合體腔側亞基5（PcPNSL5）、類囊體彎曲蛋白1A/1B/1C（PcCURT1A/1B/1C，定位于葉綠體）、ATP 合酶α亞基（PcatpA，定位于葉綠體）以及ATP合酶δ亞基（PcATPD，定位于葉綠體）；
（c）膜內在蛋白：如質膜內在蛋白2-5（PcPIP2-5）、液泡膜內在蛋白1-3（PcTIP1-3）和液泡膜內在蛋白2-1（PcTIP2-1）；
（d）抗氧化酶：包括鐵型超氧化物歧化酶（PcSOD[Fe]）和L-抗壞血酸過氧化物酶（PcAPX2）。
作者采用RT-qPCR檢測了CdCl2處理后野生型（WT）和3個轉基因株系與PeCPK21相互作用的重金屬脅迫相關蛋白（HMAPs）的表達情況。結果顯示，轉基因株系中光合相關基因（PcHCF136、PcatpA）、重金屬轉運基因（PcATX1、PcCPK2、PcCPK23和PcXTH6）、抗氧化酶基因（PcAPX2、PcSOD [Fe]）、膜內在蛋白基因（PcPIP2-5、PcTIP1-3和PcTIP2-1）的表達量顯著高于WT，且這種高表達更利于楊樹應對鎘脅迫。
作者采用HaloTag pull-down、Co-IP、LCI進一步驗證PeCPK21與PcXTH6互作，并構建過PcXTH6表達株系，測定其鎘含量、木葡聚糖降解活性（XDA）及木葡聚糖含量。結果顯示，PeCPK21與PcXTH6直接互作，過表達PcXTH6可通過提高XDA、降低木葡聚糖含量，減少細胞壁上的 Cd²⁺結合位點，從而降低楊樹對鎘的吸收與積累。
在CdCl₂處理后下，PeCPK21轉基因楊樹維持了較高的PcSOD[Fe]表達水平，這表明PeCPK21可通過與抗氧化酶相互作用來維持ROS穩態。為明確PcSOD[Fe]在Cd²⁺脅迫下抗氧化防御中的積極作用，作者進一步構建了PcSOD[Fe]過表達株系，并測定其ROS含量及抗氧化酶活性。結果顯示，PeCPK21與PcSOD[Fe]互作，過表達PcSOD[Fe] 能顯著提高鎘脅迫下POD、CAT、SOD活性，減少ROS積累，增強楊樹的鎘耐受性。
本文綜合運用基因過表達、分子互作驗證、生理與分子指標測定等方法，證實PeCPK21通過與HMAPs（重金屬轉運相關蛋白、光合相關蛋白、膜內在蛋白、抗氧化酶）相互作用，限制Cd²⁺積累、增強ROS清除能力、維持光合效率與水分平衡，從而提高歐洲山楊×銀白楊對高濃度鎘脅迫的耐受性，為木本植物鎘耐受遺傳改良提供理論依據。
藍景科信HaloTag pull-down優勢：
1、采用真核無細胞蛋白表達系統，表達蛋白可進行翻譯后修飾，更接近體內真實蛋白狀態。
2、無需轉化和鑒定，可直接表達目的蛋白，節省實驗時間。
3、蛋白表達成功率高，系統模擬真核細胞折疊環境、無活細胞內空間擁擠限制，表達產物無包涵體。
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