文獻(xiàn)解讀：m6A甲基化在炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中的表觀調(diào)控作用
近日，安徽醫(yī)科大學(xué)徐亞運(yùn)、柳文強(qiáng)為共同第一作者，陳飛虎教授為唯一通訊作者，在《INT J BIOL MACROMOL》（簡稱IJBM)期刊發(fā)表題為“METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner”的科研成果。研究聚焦于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis, RA）滑膜成纖維細(xì)胞（Synovial Fibroblasts, SFs）的腫瘤樣特性（tumor-like characteristics），探討了N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）修飾在RA發(fā)病機(jī)制中的作用，特別是METTL3通過m6A修飾增強(qiáng)SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性，進(jìn)而影響RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的分子機(jī)制。
標(biāo)題：METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner（METTL3通過m6A-IGF2BP2依賴性方式增強(qiáng)SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性，提高鐵死亡抗性，從而促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的腫瘤樣特性）
發(fā)表時(shí)間：2025年7月5日
發(fā)表期刊：INT J BIOL MACROMOL
影響因子：IF8.5/Q2
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq
DOI:10.1016/j.ijbiomac.2025.145698
激活的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）表現(xiàn)出腫瘤樣特性，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的關(guān)節(jié)破壞中起著重要作用。m6A作為mRNA上的重要修飾，參與多種生物過程，然而其在RA發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚未完全明確。本研究旨在探討m6A甲基化對RASFs增殖、遷移和侵襲的作用及其潛在機(jī)制。研究結(jié)果揭示RA患者滑膜和滑膜成纖維細(xì)胞中METTL3表達(dá)上調(diào)。敲低METTL3可減少RASFs增殖、遷移和侵襲。具體而言，METTL3介導(dǎo)SLC7A11 mRNA的m6A修飾，通過與胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）互作以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。此外，METTL3敲低加速RASFs中erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，并進(jìn)一步抑制RASFs腫瘤樣特性。通過在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）小鼠模型的關(guān)節(jié)內(nèi)注射攜帶shMETTL3的慢病毒實(shí)驗(yàn)顯示出關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度減輕和抑制滑膜成纖維細(xì)胞侵襲行為。總之，本研究結(jié)果表明，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在RA滑膜增生和侵襲的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。靶向METTL3治療干預(yù)可能為RA的治療提供一種新方法。
示意圖：METTL3介導(dǎo)的SLC7A11 m6A修飾參與RASFs增殖、遷移和侵襲
易小結(jié)
本研究通過MeRIP-seq和RNA-seq等組學(xué)技術(shù)，揭示了METTL3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜成纖維細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。表觀組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的整合研究不僅揭示了RA的分子機(jī)制，還為未來類似研究提供了新的思路和方法。
易基因提供的表觀基因組技術(shù)，如MeRIP-seq，已經(jīng)在多種疾病研究中得到應(yīng)用，包括癌癥、心血管疾病和自身免疫性疾病，為深入理解疾病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略提供了重要支持，在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。易基因提供的表觀基因組學(xué)技術(shù)，不僅為科研人員提供了全面的解決方案，還推動(dòng)了表觀遺傳學(xué)研究的前沿發(fā)展。
研究方法
（1）RA患者滑膜和滑膜成纖維細(xì)胞中m6A水平及m6A修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)
在RA患者的滑膜組織中，m6A修飾水平顯著高于對照組（圖1A）。與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者相比，RA患者的滑膜中METTL3蛋白水平顯著升高（圖1B-C）。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型中，研究人員也觀察到滑膜組織中METTL3蛋白水平的上調(diào)（圖1D-E）。
為全面了解METTL3在RA中的作用，研究人員還比較了RA患者滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）和正常滑膜成纖維細(xì)胞（NSFs）中METTL3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，無論是mRNA水平還是蛋白水平，METTL3在RASFs中的表達(dá)均顯著高于NSFs（圖1F-H）。此外，RA患者的滑膜中METTL3蛋白水平與紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C反應(yīng)蛋白（CRP）水平呈正相關(guān)（圖1I-J）。這些結(jié)果表明，METTL3在RA的發(fā)病機(jī)制中可能存在關(guān)鍵作用。
圖1：RA患者滑膜和SFs中METTL3表達(dá)增加。
A. 采用點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測RA患者和關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者滑膜中m6A的水平。
(B-C) 通過免疫組化分析RA患者和健康對照者FLSs中m6A甲基化相關(guān)酶的表達(dá)。
(D-E) 通過免疫組化分析CIA小鼠和對照小鼠滑膜中METTL3的表達(dá)。
(F-H) 通過(F)RT-qPCR和(G和H)免疫熒光分析RASF和NSF中METTL3的表達(dá)。
(I) 分析RA患者滑膜中METTL3與ESR的相關(guān)性。
(J) 分析RA患者滑膜中METTL3與CRP的相關(guān)性。
（2）METTL3敲低抑制RASFs的增殖、遷移和侵襲
通過siRNA技術(shù)敲低METTL3后，RASFs的增殖能力顯著降低，如CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)所示（圖2A-C）。此外，METTL3敲低還抑制RASFs的遷移和侵襲能力，通過Transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（圖2D-H）。這些結(jié)果表明，METTL3在RASFs的腫瘤樣特性中發(fā)揮重要作用。
（D-F）Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示METTL3敲低對RASFs遷移和侵襲的作用。
（G-H）傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示METTL3敲低對RASFs遷移能力的作用。
（3）SLC7A11是METTL3在RASFs中的m6A修飾靶點(diǎn)
通過m6A測序（m6A-seq）和RNA測序（RNA-seq）技術(shù)，研究人員對METTL3敲低的RASFs進(jìn)行了全面的多組學(xué)分析。分析結(jié)果揭示，METTL3敲低的RASFs中SLC7A11 mRNA的m6A修飾顯著減少（圖3B）。SLC7A11蛋白水平在METTL3敲低后也顯著降低（圖3C-D）。此外，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了METTL3對SLC7A11 mRNA的m6A修飾作用（圖3E-F）。這些結(jié)果表明，METTL3通過m6A修飾調(diào)控SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性。
附圖3：m6A-seq（MeRIP-seq）和RNA-seq鑒定METTL3的下游靶點(diǎn)。
（A）差異表達(dá)基因的火山圖。
（B）差異m6A修飾位點(diǎn)的火山圖。
（C）m6A水平和mRNA表達(dá)水平顯著變化的基因分布。
(B) 通過MeRIP-qPCR檢測METTL3缺失的RASFs與siRNA-NC細(xì)胞相比NRG1、CKAP2L、SLC7A11、ZBTB2和GRPR的m6A修飾。
(C-D) METTL3敲低后RASFs中SLC7A11蛋白的表達(dá)。
(E-F) 通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SLC7A11和METTL3的互作。
(G-I) 通過免疫組化評(píng)估RA患者和CIA小鼠滑膜中METTL3的表達(dá)。
(J) 通過RT-qPCR評(píng)估RASF和NSF中METTL3的mRNA表達(dá)。
(K-L) 通過免疫熒光評(píng)估RASF和NSF中METTL3的蛋白表達(dá)。
（4）METTL3敲低加速erastin誘導(dǎo)的鐵死亡并進(jìn)一步抑制RASFs的腫瘤樣特性
在RASFs中，METTL3敲低加速了erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低、GSH水平下降、MDA水平升高以及ROS水平增加（圖4A-E）。此外，METTL3敲低進(jìn)一步抑制erastin處理的RASFs腫瘤樣特性，如增殖、遷移和侵襲能力的降低（圖5A-H）。這些結(jié)果表明，METTL3通過調(diào)控鐵死亡促進(jìn)RASFs的腫瘤樣特性。
(B) 通過透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。
(C) 利用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS釋放。
(D) 檢測GSH水平。
(E) 檢測MDA水平。
(B-C) 利用EdU染色檢測RASFs的增殖情況。
(D-F) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測RASFs的趨化遷移和侵襲能力。
(G-H) 通過創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)分析RASFs的遷移能力。
（5）鑒定出SLC7A11 mRNA上m6A修飾的reader蛋白IGF2BP2，其介導(dǎo)穩(wěn)定性和表達(dá)增加
通過RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2能與SLC7A11 mRNA結(jié)合，并且這種結(jié)合依賴于m6A修飾（圖6C-F）。IGF2BP2的過表達(dá)部分抵消了METTL3敲低對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡作用（圖7E-H）。這些結(jié)果表明，IGF2BP2通過介導(dǎo)SLC7A11 mRNA上的m6A修飾，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性和表達(dá)。
(B) 通過RT-qPCR檢測IGF2BPs敲低對SLC7A11 mRNA表達(dá)的影響。
(C) RIP-qPCR結(jié)果顯示了SLC7A11與RASFs中的IGF2BPs的關(guān)聯(lián)。
(D) 經(jīng)ActD（5μg/ml）處理后，RT-qPCR在指定時(shí)間點(diǎn)檢測有或沒有IGF2BP2缺失的RASFs中SLC7A11 mRNA衰變率。
(E) 在有或沒有IGF2BP2敲低的RASFs中，檢測WT和Mutpmir-GLO質(zhì)粒的熒光素酶活性。
(F) RIP分析揭示在DAA抑制SLC7A11的m6A甲基化后，SLC7A11與IGF2BP2的結(jié)合。
（6）SLC7A11或IGF2BP2過表達(dá)挽救了METTL3敲低促進(jìn)的erastin誘導(dǎo)的鐵死亡
SLC7A11或IGF2BP2過表達(dá)部分抵消了METTL3敲低對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，表現(xiàn)為線粒體膜電位和GSH水平的增加，以及MDA水平的降低（圖7A-D）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SLC7A11和IGF2BP2在METTL3調(diào)控鐵死亡中的重要作用。
(B) SLC7A11過表達(dá)對線粒體形態(tài)的影響。
(C) SLC7A11過表達(dá)對GSH水平的影響。
(D) SLC7A11過表達(dá)對MDA水平的影響。
(E) IGF2BP2過表達(dá)對線粒體膜電位的影響。
(F) IGF2BP2過表達(dá)對線粒體形態(tài)的影響。
(G) IGF2BP2過表達(dá)對GSH水平的影響。
(H) IGF2BP2過表達(dá)對MDA水平的影響。
（7）局部敲低METTL3減輕RA模型中的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度
在CIA小鼠模型中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射攜帶METTL3 shRNA的AAV9載體，顯著減輕了關(guān)節(jié)炎癥狀，包括關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生和軟骨侵蝕（圖8B-J）。這些結(jié)果表明，METTL3的局部敲低是一種潛在的RA治療策略。
(B) sh-METTL3對CIA小鼠體重的影響。
(C) sh-METTL3對CIA小鼠多關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響。
(D) 關(guān)節(jié)的H&E染色、甲苯胺藍(lán)染色(toluidine blue)、番紅O-固綠染色以及SLC7A11和METTL3免疫組化代表性圖像。
(E) 對滑膜炎癥的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(F) 對滑膜增生的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(G) 對軟骨侵蝕的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(H) 對骨侵蝕的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(I) 對滑膜中SLC7A11表達(dá)的免疫組化定量分析。
(J) 對滑膜中METTL3表達(dá)的免疫組化定量分析。
結(jié)論和啟示
本研究通過m6A-seq和RNA-seq技術(shù)，揭示了METTL3通過m6A修飾調(diào)控SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性，進(jìn)而影響RASFs的腫瘤樣特性和鐵死亡的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為RA的治療提供了新的靶點(diǎn)，特別是通過靶向METTL3或其下游靶點(diǎn)SLC7A11和IGF2BP2，可能成為治療RA的新策略。此外，本研究還強(qiáng)調(diào)了m6A修飾在自身免疫性疾病中的重要作用，為未來類似研究提供了新的思路和方法。
MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究MeRIP-seq技術(shù)不僅幫助確定了SLC7A11 mRNA上的m6A修飾位點(diǎn)，還揭示了METTL3對SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)為理解RA的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，并為開發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。未來類似的研究可以利用MeRIP-seq技術(shù)深入探索m6A修飾在其他疾病中的作用，特別是在自身免疫性疾病和癌癥中。
參考文獻(xiàn)：
Xu Y, Liu W, Zai Z, Qian X, Hu W, Peng X, Chen F. METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner. Int J Biol Macromol. 2025 Jul 5:145698. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145698.
標(biāo)題：METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner（METTL3通過m6A-IGF2BP2依賴性方式增強(qiáng)SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性，提高鐵死亡抗性，從而促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的腫瘤樣特性）
發(fā)表期刊：INT J BIOL MACROMOL
影響因子：IF8.5/Q2
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq
DOI:10.1016/j.ijbiomac.2025.145698
激活的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）表現(xiàn)出腫瘤樣特性，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的關(guān)節(jié)破壞中起著重要作用。m6A作為mRNA上的重要修飾，參與多種生物過程，然而其在RA發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚未完全明確。本研究旨在探討m6A甲基化對RASFs增殖、遷移和侵襲的作用及其潛在機(jī)制。研究結(jié)果揭示RA患者滑膜和滑膜成纖維細(xì)胞中METTL3表達(dá)上調(diào)。敲低METTL3可減少RASFs增殖、遷移和侵襲。具體而言，METTL3介導(dǎo)SLC7A11 mRNA的m6A修飾，通過與胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）互作以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。此外，METTL3敲低加速RASFs中erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，并進(jìn)一步抑制RASFs腫瘤樣特性。通過在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）小鼠模型的關(guān)節(jié)內(nèi)注射攜帶shMETTL3的慢病毒實(shí)驗(yàn)顯示出關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度減輕和抑制滑膜成纖維細(xì)胞侵襲行為。總之，本研究結(jié)果表明，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在RA滑膜增生和侵襲的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。靶向METTL3治療干預(yù)可能為RA的治療提供一種新方法。
示意圖：METTL3介導(dǎo)的SLC7A11 m6A修飾參與RASFs增殖、遷移和侵襲
易小結(jié)
本研究通過MeRIP-seq和RNA-seq等組學(xué)技術(shù)，揭示了METTL3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜成纖維細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。表觀組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的整合研究不僅揭示了RA的分子機(jī)制，還為未來類似研究提供了新的思路和方法。
易基因提供的表觀基因組技術(shù)，如MeRIP-seq，已經(jīng)在多種疾病研究中得到應(yīng)用，包括癌癥、心血管疾病和自身免疫性疾病，為深入理解疾病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略提供了重要支持，在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。易基因提供的表觀基因組學(xué)技術(shù)，不僅為科研人員提供了全面的解決方案，還推動(dòng)了表觀遺傳學(xué)研究的前沿發(fā)展。
研究方法
- 患者和組織樣本：研究納入RA患者，以及因關(guān)節(jié)創(chuàng)傷接受手術(shù)的對照組患者。從患者中獲取滑膜組織樣本，分離出滑膜成纖維細(xì)胞（SFs）。
- 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用siRNA技術(shù)敲低METTL3、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3等基因并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
- m6A修飾檢測：通過MeRIP-qPCR技術(shù)定量分析檢測m6A修飾水平。
- RNA測序（RNA-seq）和m6A測序（MeRIP-seq）：對METTL3敲低和對照組的RASFs進(jìn)行RNA-seq和MeRIP-seq，分析m6A修飾的基因表達(dá)差異。
- 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射攜帶METTL3 shRNA的腺相關(guān)病毒（AAV9）載體，評(píng)估METTL3敲低對關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的影響。
（1）RA患者滑膜和滑膜成纖維細(xì)胞中m6A水平及m6A修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)
在RA患者的滑膜組織中，m6A修飾水平顯著高于對照組（圖1A）。與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者相比，RA患者的滑膜中METTL3蛋白水平顯著升高（圖1B-C）。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型中，研究人員也觀察到滑膜組織中METTL3蛋白水平的上調(diào)（圖1D-E）。
為全面了解METTL3在RA中的作用，研究人員還比較了RA患者滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）和正常滑膜成纖維細(xì)胞（NSFs）中METTL3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，無論是mRNA水平還是蛋白水平，METTL3在RASFs中的表達(dá)均顯著高于NSFs（圖1F-H）。此外，RA患者的滑膜中METTL3蛋白水平與紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C反應(yīng)蛋白（CRP）水平呈正相關(guān)（圖1I-J）。這些結(jié)果表明，METTL3在RA的發(fā)病機(jī)制中可能存在關(guān)鍵作用。
圖1：RA患者滑膜和SFs中METTL3表達(dá)增加。
(B-C) 通過免疫組化分析RA患者和健康對照者FLSs中m6A甲基化相關(guān)酶的表達(dá)。
(D-E) 通過免疫組化分析CIA小鼠和對照小鼠滑膜中METTL3的表達(dá)。
(F-H) 通過(F)RT-qPCR和(G和H)免疫熒光分析RASF和NSF中METTL3的表達(dá)。
(I) 分析RA患者滑膜中METTL3與ESR的相關(guān)性。
(J) 分析RA患者滑膜中METTL3與CRP的相關(guān)性。
（2）METTL3敲低抑制RASFs的增殖、遷移和侵襲
通過siRNA技術(shù)敲低METTL3后，RASFs的增殖能力顯著降低，如CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)所示（圖2A-C）。此外，METTL3敲低還抑制RASFs的遷移和侵襲能力，通過Transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（圖2D-H）。這些結(jié)果表明，METTL3在RASFs的腫瘤樣特性中發(fā)揮重要作用。
圖2：METTL3敲低抑制RASFs的增殖、遷移和侵襲。
（A-C）CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示METTL3敲低對RASFs增殖的作用。（D-F）Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示METTL3敲低對RASFs遷移和侵襲的作用。
（G-H）傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示METTL3敲低對RASFs遷移能力的作用。
（3）SLC7A11是METTL3在RASFs中的m6A修飾靶點(diǎn)
通過m6A測序（m6A-seq）和RNA測序（RNA-seq）技術(shù)，研究人員對METTL3敲低的RASFs進(jìn)行了全面的多組學(xué)分析。分析結(jié)果揭示，METTL3敲低的RASFs中SLC7A11 mRNA的m6A修飾顯著減少（圖3B）。SLC7A11蛋白水平在METTL3敲低后也顯著降低（圖3C-D）。此外，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了METTL3對SLC7A11 mRNA的m6A修飾作用（圖3E-F）。這些結(jié)果表明，METTL3通過m6A修飾調(diào)控SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性。
附圖3：m6A-seq（MeRIP-seq）和RNA-seq鑒定METTL3的下游靶點(diǎn)。
（B）差異m6A修飾位點(diǎn)的火山圖。
（C）m6A水平和mRNA表達(dá)水平顯著變化的基因分布。
圖3：METTL3介導(dǎo)SLC7A11 mRNA的m6A修飾，增強(qiáng)其表達(dá)。
(A) 通過RT-qPCR分析METTL3缺失的RASFs與siRNA-NC細(xì)胞相比NRG1、CKAP2L、SLC7A11、ZBTB2和GRPR的表達(dá)。(B) 通過MeRIP-qPCR檢測METTL3缺失的RASFs與siRNA-NC細(xì)胞相比NRG1、CKAP2L、SLC7A11、ZBTB2和GRPR的m6A修飾。
(C-D) METTL3敲低后RASFs中SLC7A11蛋白的表達(dá)。
(E-F) 通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證SLC7A11和METTL3的互作。
(G-I) 通過免疫組化評(píng)估RA患者和CIA小鼠滑膜中METTL3的表達(dá)。
(J) 通過RT-qPCR評(píng)估RASF和NSF中METTL3的mRNA表達(dá)。
(K-L) 通過免疫熒光評(píng)估RASF和NSF中METTL3的蛋白表達(dá)。
（4）METTL3敲低加速erastin誘導(dǎo)的鐵死亡并進(jìn)一步抑制RASFs的腫瘤樣特性
在RASFs中，METTL3敲低加速了erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低、GSH水平下降、MDA水平升高以及ROS水平增加（圖4A-E）。此外，METTL3敲低進(jìn)一步抑制erastin處理的RASFs腫瘤樣特性，如增殖、遷移和侵襲能力的降低（圖5A-H）。這些結(jié)果表明，METTL3通過調(diào)控鐵死亡促進(jìn)RASFs的腫瘤樣特性。
圖4：METTL3敲低加速RASFs中erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。
(A) 采用JC-1染色檢測線粒體膜電位。(B) 通過透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。
(C) 利用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS釋放。
(D) 檢測GSH水平。
(E) 檢測MDA水平。
圖5：METTL3敲低抑制經(jīng)erastin處理的RASFs腫瘤樣特性。
(A) 通過CCK-8實(shí)驗(yàn)監(jiān)測RASFs的生長曲線。(B-C) 利用EdU染色檢測RASFs的增殖情況。
(D-F) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測RASFs的趨化遷移和侵襲能力。
(G-H) 通過創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)分析RASFs的遷移能力。
（5）鑒定出SLC7A11 mRNA上m6A修飾的reader蛋白IGF2BP2，其介導(dǎo)穩(wěn)定性和表達(dá)增加
通過RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2能與SLC7A11 mRNA結(jié)合，并且這種結(jié)合依賴于m6A修飾（圖6C-F）。IGF2BP2的過表達(dá)部分抵消了METTL3敲低對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡作用（圖7E-H）。這些結(jié)果表明，IGF2BP2通過介導(dǎo)SLC7A11 mRNA上的m6A修飾，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性和表達(dá)。
圖6：IGF2BP2識(shí)別SLC7A11 mRNA的m6A修飾并增強(qiáng)其穩(wěn)定性和表達(dá)。
(A) 經(jīng)ActD（5μg/ml）處理后，RT-qPCR在指定時(shí)間點(diǎn)檢測有或沒有METTL3缺失的RASFs中SLC7A11 mRNA衰變率。(B) 通過RT-qPCR檢測IGF2BPs敲低對SLC7A11 mRNA表達(dá)的影響。
(C) RIP-qPCR結(jié)果顯示了SLC7A11與RASFs中的IGF2BPs的關(guān)聯(lián)。
(D) 經(jīng)ActD（5μg/ml）處理后，RT-qPCR在指定時(shí)間點(diǎn)檢測有或沒有IGF2BP2缺失的RASFs中SLC7A11 mRNA衰變率。
(E) 在有或沒有IGF2BP2敲低的RASFs中，檢測WT和Mutpmir-GLO質(zhì)粒的熒光素酶活性。
(F) RIP分析揭示在DAA抑制SLC7A11的m6A甲基化后，SLC7A11與IGF2BP2的結(jié)合。
（6）SLC7A11或IGF2BP2過表達(dá)挽救了METTL3敲低促進(jìn)的erastin誘導(dǎo)的鐵死亡
SLC7A11或IGF2BP2過表達(dá)部分抵消了METTL3敲低對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，表現(xiàn)為線粒體膜電位和GSH水平的增加，以及MDA水平的降低（圖7A-D）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SLC7A11和IGF2BP2在METTL3調(diào)控鐵死亡中的重要作用。
圖7：SLC7A11或IGF2BP2過表達(dá)挽救了由METTL3敲低促進(jìn)的erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。
(A) SLC7A11過表達(dá)對線粒體膜電位的影響。(B) SLC7A11過表達(dá)對線粒體形態(tài)的影響。
(C) SLC7A11過表達(dá)對GSH水平的影響。
(D) SLC7A11過表達(dá)對MDA水平的影響。
(E) IGF2BP2過表達(dá)對線粒體膜電位的影響。
(F) IGF2BP2過表達(dá)對線粒體形態(tài)的影響。
(G) IGF2BP2過表達(dá)對GSH水平的影響。
(H) IGF2BP2過表達(dá)對MDA水平的影響。
（7）局部敲低METTL3減輕RA模型中的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度
在CIA小鼠模型中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射攜帶METTL3 shRNA的AAV9載體，顯著減輕了關(guān)節(jié)炎癥狀，包括關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生和軟骨侵蝕（圖8B-J）。這些結(jié)果表明，METTL3的局部敲低是一種潛在的RA治療策略。
圖8：關(guān)節(jié)內(nèi)注射METTL3 shRNA對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的影響。
(A) CIA模型的誘導(dǎo)和干預(yù)示意圖。(B) sh-METTL3對CIA小鼠體重的影響。
(C) sh-METTL3對CIA小鼠多關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響。
(D) 關(guān)節(jié)的H&E染色、甲苯胺藍(lán)染色(toluidine blue)、番紅O-固綠染色以及SLC7A11和METTL3免疫組化代表性圖像。
(E) 對滑膜炎癥的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(F) 對滑膜增生的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(G) 對軟骨侵蝕的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(H) 對骨侵蝕的組織形態(tài)學(xué)分析的定量分析。
(I) 對滑膜中SLC7A11表達(dá)的免疫組化定量分析。
(J) 對滑膜中METTL3表達(dá)的免疫組化定量分析。
結(jié)論和啟示
本研究通過m6A-seq和RNA-seq技術(shù)，揭示了METTL3通過m6A修飾調(diào)控SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性，進(jìn)而影響RASFs的腫瘤樣特性和鐵死亡的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為RA的治療提供了新的靶點(diǎn)，特別是通過靶向METTL3或其下游靶點(diǎn)SLC7A11和IGF2BP2，可能成為治療RA的新策略。此外，本研究還強(qiáng)調(diào)了m6A修飾在自身免疫性疾病中的重要作用，為未來類似研究提供了新的思路和方法。
MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究MeRIP-seq技術(shù)不僅幫助確定了SLC7A11 mRNA上的m6A修飾位點(diǎn)，還揭示了METTL3對SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)為理解RA的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，并為開發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。未來類似的研究可以利用MeRIP-seq技術(shù)深入探索m6A修飾在其他疾病中的作用，特別是在自身免疫性疾病和癌癥中。
參考文獻(xiàn)：
Xu Y, Liu W, Zai Z, Qian X, Hu W, Peng X, Chen F. METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner. Int J Biol Macromol. 2025 Jul 5:145698. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145698.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
- 單細(xì)胞擬時(shí)序分析技術(shù)的核心特征、原理、分析步驟及應(yīng)用場景
- 現(xiàn)貨型新生抗原疫苗聯(lián)合ICI在晚期纖維板層型肝癌中展現(xiàn)治療潛力
- 解鎖細(xì)胞年齡的密碼：端粒檢測如何成為健康管理新視角？
- 多組學(xué)分析揭示DNA低甲基化定義人組織調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表觀遺傳適應(yīng)性
- Polysome Profiling—解析翻譯調(diào)控機(jī)制的金標(biāo)準(zhǔn)
- Ribo-seq—檢測正在翻譯的RNA信息 連接轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的橋梁
- Science：利用大規(guī)模并行核糖體分析發(fā)現(xiàn)泛病毒ORF
- 微量WGBS揭示DNA甲基化調(diào)控斑馬魚造血干細(xì)胞發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制
- 伯豪&真邁簽署戰(zhàn)略合作協(xié)議，共建多組學(xué)應(yīng)用新平臺(tái)
- 伯豪生物攜時(shí)空組學(xué)技術(shù)平臺(tái)亮相全國系統(tǒng)生物學(xué)大會(huì)
- 開學(xué)季促銷，LabEx DSP空間組學(xué)測序免費(fèi)送12個(gè)ROI
- 新址新程，豪創(chuàng)未來-伯豪生物喬遷慶典圓滿舉行
- 樂備實(shí)LabEx助力發(fā)文獎(jiǎng)勵(lì)進(jìn)行中，最高獲2000元現(xiàn)金
- 中國首批AVITI24原位多組學(xué)平臺(tái)實(shí)測數(shù)據(jù)發(fā)布
- 伯豪生物2025系列培訓(xùn)班（上海站）報(bào)名開啟
- 2025伯豪生物春季全國巡講開啟，早鳥報(bào)名搶占先機(jī)
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com