Western實驗中HIF-1α空白條帶的原因及解決方法
很多剛接觸HIF-1α的同學們很容易碰到一個問題，就是做的Western老是空白條帶，什么都沒有。今天我們就帶著這個問題，一起深入了解下這個缺氧大明星。
發現
HIF-1的發現得感謝上面三位科學家。我們一直知道氧氣的重要性，卻不清楚細胞是如何適應氧氣水平的變化。這三位科學家為大家揭示了細胞水平的分子機理以及核心蛋白HIF-1，從而獲得諾貝爾生理學或醫學獎。
簡單描述下發現的過程：首先在缺氧情況下，發現細胞內的促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)會大量表達，然后發現了增強EPO表達的關鍵區域——缺氧反應元件(Hypoxia Response Element，HRE)。最后發現與HRE特異性結合的蛋白——缺氧誘導因子(Hypoxia-Inducible Factor, HIF）。
結構
HIF-1結構上是一個異源二聚體，其中一個命名為HIF-1α，另外一個，命名為HIF-1β。HIF-1β又叫芳香烴受體核轉運因子(Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator，ARNT)。研究發現，HIF-1β對氧氣含量的變化并不敏感，所以我們的主角就是HIF-1α了。
HIF家族結構域示意圖
HIF家族有共同的兩個結構域：一個是紫色部分的堿性螺旋-環-螺旋結構域(Basic Helix-Loop-Helix, bHLH)，一個是綠色部分的Per-ARNT-Sim結構域(Periodicity-ARNT-Single-minded，PAS）。這兩個結構域是 HIF-1α 和 HIF-1β 亞基形成異二聚體所必需的。
藍色是氧依賴降解結構域(Oxygen-Dependent Degradation, ODD)，是HIF1受氧調控的關鍵部位，這個我們下部分細講。N-TAD和C-TAD是兩個反式激活結構域(transactivation domain, TAD)，N-TAD位于ODD結構域，C-TAD 可以和CBP/p300 等相互作用共同激活下游基因。這兩個結構域共同負責HIF-1α轉錄活性。
HIF-2α在 HIF-1α被發現不久后就被克隆出來了。HIF-2α與HIF-1α有 48% 的氨基酸序列是相同的，功能也類似，可以與HIF-1β形成異二聚體并結合HRE。不過與HIF-1α的普遍表達不同的是，HIF-2α主要表達在肺，內皮，頸動脈中。
后來發現的HIF-3α也在多種組織中表達，同樣與 HIF-1β 形成異二聚體并結合HRE。不過目前HIF-1α 和 HIF-2α研究更加廣泛，而HIF-3α和其他HIF亞型研究較少，還有待大家去研究。
降解
為什么HIF-1α Western難做呢，主要就是因為常氧快速降解，還沒等你檢測，就已經沒有了。
HIF-1α信號通路
我們一起來看上面的通路圖，在常氧條件下，HIF-1α 會發生脯氨酸羥基化（402和564位點都是脯氨酸），細心的同學還可以看到圖中K532也同時發生了乙酰化。這時馮·希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumor suppressor protein，VHL) 就會結合到HIF-1α，發生泛素化，形成E3泛素連接酶復合體。隨后發生蛋白酶體降解。
而在右邊的缺氧條件下，HIF-1α沒有了VHL這個蛋白的限制，不發生泛素化降解，從而不斷積累進入細胞核，調控下游基因的表達。如果我們使用一些羥化酶抑制劑，例如DFO去鐵胺和氯化鈷等，同樣可以阻斷HIF-1α的降解，使HIF-1α的水平上調。
還需要注意的是，HIF-1α的降解不是只通過VHL調控。研究報道還有許多其他蛋白可以影響 HIF-1α的泛素化和穩定性。例如P53可以通過MDM2來降解HIF-1α；Jab1又可以增加HIF-1α的表達水平。此外，VHL 也與 HIF-1信號通路的其他蛋白有相互作用，因此VHL調節的不僅只是HIF-1α 穩定性。生物體如此復雜，大部分蛋白調控都是交錯進行的。
常見問題
1.無條帶
做HIF-1α蛋白最常見的問題就是無條帶。在我們的咨詢中，無條帶的比例占到了80%。
碰到無條帶的情況，首先要確認你的樣本是否表達或高表達HIF-1α，是否使用低氧誘導，低氧誘導是否成功，這些都可以通過上下游蛋表達變化以及功能實驗去綜合判斷的。
有的同學說我做的不是低氧誘導，是藥物誘導，那么最好在旁邊添加一個低氧誘導的陽性對照來排查問題。
小優細節君建議
陽性對照推薦0.5%氧氣培養24h。如果沒有低氧培養箱，建議使用氯化鈷(100µM，4h)或者DMOG(1mM，6h)來處理細胞。
如果樣本表達和低氧誘導都沒有問題，還有一個關鍵點需要注意，就是蛋白提取操作是否成功。因為HIF-1α低氧誘導后主要在細胞核累積，所以提取蛋白時使用的裂解液和方法要充分裂解核蛋白。
建議使用裂解效果強的RIPA裂解液或者SDS裂解液，保證可以裂解核膜。裂解完增加超聲步驟，完全破碎細胞膜和細胞核膜，打斷DNA，充分釋放蛋白，同時可以增加樣本的均一性。建議每次超5～10S，間隔20S，共三個循環。超聲時需要根樣本體積及所用的探頭大小調整超聲功率，盡量保證在超聲過程中樣本不起泡，超聲后樣本變得澄清。
如果有同學說實驗室沒有超聲儀器怎么辦，可以使用1ml注射器，來回抽進打出5～10次，到沒有阻力為止。做Western時也可以做一下核內參。
2.條帶位置不對
HIF-1α理論分子量在93KD，實際上由于蛋白的多種修飾，尤其是泛素化修飾，呈現出來的分子量在110-120KD左右。我們之前就碰到有同學只裁窄窄的兩個marker之間的部分，很有可能將目的蛋白丟失。
小優細節君建議
在跑HIF-1α一定要把膜裁寬一些，將70-150KD蛋白全部轉上去。這里還需要注意，預染marker由于偶聯了染料，出現5-10KD遷移偏差是很正常的現象。如果樣本條帶趨勢符合造模，且條帶位置和陽性對照一致，只是條帶出現在了130 KD位置，我們可以基本確認是目的條帶。
3.為什么HIF-1β/ARNT能做出來，HIF-1α做不出來？
這個問題其實仔細看過上文的同學們是可以找到答案的。因為HIF-1β對氧氣含量的變化并不敏感，也就是說正常的細胞組織是可以檢測出HIF-1β的。我們看下圖，同樣的HepG2細胞，只有CoCl2處理后才能檢測到HIF-1α，而未處理的HepG2就可以檢測到HIF-1β。
小優細節君建議
如果想通過其他亞型的表達情況來確認HIF-1α表達，建議可以做下HIF-2α。這兩個蛋白比較相近，可以說明一定問題。
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發現
美國癌癥學家威廉·凱林(William G. Kaelin, Jr.)
英國醫學家彼得·拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)
美國醫學家格雷格·塞門扎(Gregg L. Semenza)
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HIF-1的發現得感謝上面三位科學家。我們一直知道氧氣的重要性，卻不清楚細胞是如何適應氧氣水平的變化。這三位科學家為大家揭示了細胞水平的分子機理以及核心蛋白HIF-1，從而獲得諾貝爾生理學或醫學獎。
簡單描述下發現的過程：首先在缺氧情況下，發現細胞內的促紅細胞生成素(Erythropoietin, EPO)會大量表達，然后發現了增強EPO表達的關鍵區域——缺氧反應元件(Hypoxia Response Element，HRE)。最后發現與HRE特異性結合的蛋白——缺氧誘導因子(Hypoxia-Inducible Factor, HIF）。
結構
HIF-1結構上是一個異源二聚體，其中一個命名為HIF-1α，另外一個，命名為HIF-1β。HIF-1β又叫芳香烴受體核轉運因子(Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator，ARNT)。研究發現，HIF-1β對氧氣含量的變化并不敏感，所以我們的主角就是HIF-1α了。
HIF家族結構域示意圖
HIF家族有共同的兩個結構域：一個是紫色部分的堿性螺旋-環-螺旋結構域(Basic Helix-Loop-Helix, bHLH)，一個是綠色部分的Per-ARNT-Sim結構域(Periodicity-ARNT-Single-minded，PAS）。這兩個結構域是 HIF-1α 和 HIF-1β 亞基形成異二聚體所必需的。
藍色是氧依賴降解結構域(Oxygen-Dependent Degradation, ODD)，是HIF1受氧調控的關鍵部位，這個我們下部分細講。N-TAD和C-TAD是兩個反式激活結構域(transactivation domain, TAD)，N-TAD位于ODD結構域，C-TAD 可以和CBP/p300 等相互作用共同激活下游基因。這兩個結構域共同負責HIF-1α轉錄活性。
HIF-2α在 HIF-1α被發現不久后就被克隆出來了。HIF-2α與HIF-1α有 48% 的氨基酸序列是相同的，功能也類似，可以與HIF-1β形成異二聚體并結合HRE。不過與HIF-1α的普遍表達不同的是，HIF-2α主要表達在肺，內皮，頸動脈中。
后來發現的HIF-3α也在多種組織中表達，同樣與 HIF-1β 形成異二聚體并結合HRE。不過目前HIF-1α 和 HIF-2α研究更加廣泛，而HIF-3α和其他HIF亞型研究較少，還有待大家去研究。
降解
為什么HIF-1α Western難做呢，主要就是因為常氧快速降解，還沒等你檢測，就已經沒有了。
HIF-1α信號通路
我們一起來看上面的通路圖，在常氧條件下，HIF-1α 會發生脯氨酸羥基化（402和564位點都是脯氨酸），細心的同學還可以看到圖中K532也同時發生了乙酰化。這時馮·希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumor suppressor protein，VHL) 就會結合到HIF-1α，發生泛素化，形成E3泛素連接酶復合體。隨后發生蛋白酶體降解。
而在右邊的缺氧條件下，HIF-1α沒有了VHL這個蛋白的限制，不發生泛素化降解，從而不斷積累進入細胞核，調控下游基因的表達。如果我們使用一些羥化酶抑制劑，例如DFO去鐵胺和氯化鈷等，同樣可以阻斷HIF-1α的降解，使HIF-1α的水平上調。
還需要注意的是，HIF-1α的降解不是只通過VHL調控。研究報道還有許多其他蛋白可以影響 HIF-1α的泛素化和穩定性。例如P53可以通過MDM2來降解HIF-1α；Jab1又可以增加HIF-1α的表達水平。此外，VHL 也與 HIF-1信號通路的其他蛋白有相互作用，因此VHL調節的不僅只是HIF-1α 穩定性。生物體如此復雜，大部分蛋白調控都是交錯進行的。
常見問題
1.無條帶
做HIF-1α蛋白最常見的問題就是無條帶。在我們的咨詢中，無條帶的比例占到了80%。
碰到無條帶的情況，首先要確認你的樣本是否表達或高表達HIF-1α，是否使用低氧誘導，低氧誘導是否成功，這些都可以通過上下游蛋表達變化以及功能實驗去綜合判斷的。
有的同學說我做的不是低氧誘導，是藥物誘導，那么最好在旁邊添加一個低氧誘導的陽性對照來排查問題。
小優細節君建議
陽性對照推薦0.5%氧氣培養24h。如果沒有低氧培養箱，建議使用氯化鈷(100µM，4h)或者DMOG(1mM，6h)來處理細胞。
如果樣本表達和低氧誘導都沒有問題，還有一個關鍵點需要注意，就是蛋白提取操作是否成功。因為HIF-1α低氧誘導后主要在細胞核累積，所以提取蛋白時使用的裂解液和方法要充分裂解核蛋白。
建議使用裂解效果強的RIPA裂解液或者SDS裂解液，保證可以裂解核膜。裂解完增加超聲步驟，完全破碎細胞膜和細胞核膜，打斷DNA，充分釋放蛋白，同時可以增加樣本的均一性。建議每次超5～10S，間隔20S，共三個循環。超聲時需要根樣本體積及所用的探頭大小調整超聲功率，盡量保證在超聲過程中樣本不起泡，超聲后樣本變得澄清。
如果有同學說實驗室沒有超聲儀器怎么辦，可以使用1ml注射器，來回抽進打出5～10次，到沒有阻力為止。做Western時也可以做一下核內參。
2.條帶位置不對
HIF-1α理論分子量在93KD，實際上由于蛋白的多種修飾，尤其是泛素化修飾，呈現出來的分子量在110-120KD左右。我們之前就碰到有同學只裁窄窄的兩個marker之間的部分，很有可能將目的蛋白丟失。
Uniprot上HIF-1α的修飾
小優細節君建議
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3.為什么HIF-1β/ARNT能做出來，HIF-1α做不出來？
這個問題其實仔細看過上文的同學們是可以找到答案的。因為HIF-1β對氧氣含量的變化并不敏感，也就是說正常的細胞組織是可以檢測出HIF-1β的。我們看下圖，同樣的HepG2細胞，只有CoCl2處理后才能檢測到HIF-1α，而未處理的HepG2就可以檢測到HIF-1β。
HepG2細胞檢測HIF-1α和HIF-1β
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參考文獻：
1. Qingdong Ke, Max Costa. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 2006 Nov;70(5):1469-80.
2. G L Semenza. HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing. Curr Opin Cell Biol. 2001 Apr;13(2):167-71.
3. Johannes Schödel, Peter J Ratcliffe. Mechanisms of hypoxia signalling: new implications for nephrology. Nat Rev Nephrol. 2019 Oct;15(10):641-659.
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