PCR反應的過程控制中的難點和解決方案

 
引言

PCR是分子生物學研究的基礎實驗之一，常做實驗的同學或許認為非常簡單，但對新人來說其實并不是那么友好。今天小編來分享下曾經踩過的那些坑（血淚史）……

 
首先，優質的模板是成功反應的前提。優質的模板需滿足以下幾點：高純度、足夠的長度、適宜的濃度。核酸純度可以用超微量分光光度計檢測的兩個比值來衡量（260/280和260/230）。當然超微量也可以檢測核酸的濃度，但不能有效反應核酸的長度。常見的動物血液、組織、或者植物組織用超微量分光光度計檢測濃度沒有問題，但石蠟包埋樣本或者石蠟切片樣本檢測就需慎重，使用超微量分光光度計檢測純度的同時需要輔助其他手段驗證其濃度是否準確，比如跑膠看一下是否有明亮光影區（包埋樣本提取的核酸在所需長度附近有明亮的片狀光影就OK了，基本沒有條帶一說）或者用染料法（Qubit）復測一下。最后再說一下適宜的濃度，擴增試劑說明書中規定模板添加體積的同時大多也會說明投入核酸的總量，這時就需要根據核酸的濃度進行簡單的計算，不足的體積用水補足，投入反應的核酸過多反而會導致非特異產物的增加。如果提取的核酸濃度過低，就只能適當的擴大添加體積，不過要適量，擴大反應體積的同時也意味著dNTPs、酶、引物等濃度的下降，進而影響擴增體系的性能。

 
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其次，搭配合理的反應體系是成功反應的保障。PCR反應的五要素，除了模板其余四項都能歸入反應體系的范疇。常規的PCR實驗中，引物的濃度相對固定，所以只要找市場上口碑不差的合成公司來合成基本不會有什么問題。需要注意的是，引物如果溶了應立即分裝凍存，最小分裝量根據每次實驗所需體積自行確定。切忌引物溶解后不進行分裝，整管凍存，反復凍融個三五次后效果就會下降不少。鎂離子、DNA聚合酶、dNTPs三者的相關性較高。dNTPs會結合鎂離子，被結合的鎂離子就無法再和DNA聚合酶結合，無法激活DNA聚合酶的活性。所以鎂離子的摩爾濃度一定要大于dNTPs的總濃度，但過高濃度的鎂離子在提高酶活和產物量的同時也提高了PCR反應的錯配率。所以如果PCR反應結束后需要對產物進行測序研究就不推薦較高的鎂離子濃度。dNTPs也是類似，較高濃度有助于獲得更多的擴增產物，但也會提高反應的錯配率。至于聚合酶，現在市場化的商品更青睞于混酶（高保真酶和Taq酶混合）既兼顧擴增反應的保真又保證了最終產物的得率。概括下來，PCR的反應產物若是需要進行測序研究就推薦相對低濃度鎂離子、dNTPs的反應體系，讓堿基序列高度保真；若是僅看擴增曲線或者產物條帶的話就推薦較高濃度的鎂離子、dNTPs的反應體系，保證有更多/高的產物、信號。注：PCR反應本身存在極低的錯配率，對于分析產物的條帶大小或者qPCR的熒光信號分析不會有影響。但若進行測序分析就需要考慮將錯配率降至不影響測序結果的水平。

最后，相匹配的反應程序是成功反應的橋梁。模板在一次次的升降溫循環中完成自身的復制過程。常見的95℃變性、55℃退火、72℃延伸適用于大多數反應，可以得到所需的目標產物。但具體到某一實驗時，還需根據引物的Tm值對反應的溫度進行微調，降低非特異擴增、增加目標產物，以期達到最佳的反應效果。

 
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