熒光定量 PCR 中無 Ct 值或 Ct 值過晚，該如何解決？

   在熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)里，無 Ct 值出現(xiàn)和 Ct 值過晚是常讓科研人員頭疼的問題。這些問題會(huì)嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，接下來我們就深入探討下背后的原因和解決辦法。

一、無 Ct 值出現(xiàn)的原因及解決辦法
（一）循環(huán)數(shù)設(shè)置不合理
正常情況下，PCR 循環(huán)數(shù)一般不宜超過 45 循環(huán)。要是循環(huán)數(shù)設(shè)置不足，可能因擴(kuò)增產(chǎn)物量不夠，熒光信號沒達(dá)到可檢測水平，導(dǎo)致無 Ct 值。比如在一些低拷貝數(shù)模板的檢測中，若循環(huán)數(shù)只設(shè) 30 次，很可能就檢測不到產(chǎn)物。
解決辦法：依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和模板預(yù)估量，合理增加循環(huán)數(shù)，不過要注意，循環(huán)數(shù)過高也會(huì)使背景值提高，定量不準(zhǔn)，通常調(diào)整到 35 - 40 循環(huán)較為合適。
（二）PCR 程序里檢測熒光信號步驟有誤
不同熒光定量方法，采集熒光信號的時(shí)機(jī)有別。像 SG 法一般在 72℃延伸時(shí)采集，TaqMan 法則多在退火結(jié)束或延伸時(shí)采集。要是 PCR 程序設(shè)置時(shí)，熒光采集步驟和所用方法不匹配，或者壓根沒勾選熒光采集選項(xiàng)，那肯定檢測不到熒光信號，也就沒有 Ct 值。
解決辦法：仔細(xì)核對所用熒光定量方法的說明書，嚴(yán)格按要求設(shè)置 PCR 程序里熒光信號檢測步驟，確保準(zhǔn)確采集熒光信號。
（三）引物或探針降解
引物或探針降解后，無法正常和模板結(jié)合并引導(dǎo)擴(kuò)增，自然不會(huì)有擴(kuò)增產(chǎn)物，也就無 Ct 值。可通過 PAGE 電泳檢測引物和探針是否降解，降解的引物或探針在電泳圖上會(huì)呈現(xiàn)出條帶模糊、拖尾等異常。
解決辦法：重新合成高質(zhì)量引物和探針，注意引物和探針的保存條件，避免反復(fù)凍融，最好小量分裝，存放在 - 20℃或 - 80℃。
（四）模板降解或上樣量不足
模板降解，完整性被破壞，擴(kuò)增難以進(jìn)行；上樣量不足，起始模板拷貝數(shù)少，擴(kuò)增產(chǎn)物量也會(huì)很少，導(dǎo)致熒光信號弱，檢測不到 Ct 值。一般模板上樣量不超 500ng，對未知濃度樣本，應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度開始實(shí)驗(yàn)。另外，樣本準(zhǔn)備過程中引入雜質(zhì)、反復(fù)凍融，都可能造成模板降解。
解決辦法：優(yōu)化樣本提取和保存方法，確保模板質(zhì)量。提取后盡快實(shí)驗(yàn)，如需保存，將模板樣本小量分裝儲備，避免反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)前，用核酸定量儀精確測定模板濃度，依據(jù)濃度調(diào)整上樣量。
（五）引物探針設(shè)計(jì)不合理
引物設(shè)計(jì)要是不合理，像上下游引物 Tm 值差異超 4℃，會(huì)影響擴(kuò)增效率，甚至導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，沒有 Ct 值；引物若不能跨越內(nèi)含子，擴(kuò)增基因組 DNA 時(shí)，可能受內(nèi)含子干擾，影響結(jié)果。
解決辦法：借助專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件，如 Primer Premier 5.0 等，精心設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)好后，進(jìn)行 BLAST 比對，確保引物特異性，避免與其他基因序列有過多同源性。

二、Ct 值過晚的原因及解決辦法
（一）擴(kuò)增效率低

• 引物間或引物與探針比例不當(dāng)：引物和探針濃度不合適，比如引物濃度過高，可能形成引物二聚體，競爭模板結(jié)合位點(diǎn)，降低擴(kuò)增效率；引物和探針比例失衡，也會(huì)影響擴(kuò)增。

解決辦法：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化引物和探針濃度及比例，摸索出最佳反應(yīng)體系。

• 引物或探針設(shè)計(jì)不合理：引物長度、GC 含量、特異性等不合適，都可能致使擴(kuò)增效率低，Ct 值過晚。比如引物長度過長，退火時(shí)難以和模板完全配對，影響擴(kuò)增。

解決辦法：重新設(shè)計(jì)引物和探針，保證引物長度適中（一般 18 - 25bp），GC 含量在 40% - 60%，同時(shí)具備高特異性。
（二）PCR 程序不合適

• 改用三步法反應(yīng)：兩步法反應(yīng)中，退火和延伸在同一溫度進(jìn)行，可能對某些模板和引物組合效果欠佳。三步法將退火、延伸分開，能更好優(yōu)化反應(yīng)條件。

解決辦法：嘗試將 PCR 程序改為三步法，即變性、退火、延伸分別在不同溫度下進(jìn)行，依據(jù)引物 Tm 值，合理設(shè)置退火溫度。

• 優(yōu)化退火 / 延伸溫度：退火溫度過高，引物和模板結(jié)合不充分；過低，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。延伸溫度不合適，會(huì)影響 Taq 酶活性和擴(kuò)增效率。

解決辦法：以引物 Tm 值為參考，適當(dāng)降低退火溫度（一般降低 3 - 5℃），優(yōu)化延伸溫度（通常 72℃左右），通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳溫度。

• 延長退火 / 延伸時(shí)間：退火或延伸時(shí)間過短，引物和模板結(jié)合不充分，擴(kuò)增產(chǎn)物合成不完全，導(dǎo)致 Ct 值過晚。

解決辦法：在推薦時(shí)間基礎(chǔ)上，適當(dāng)延長退火 / 延伸時(shí)間 10s 左右，觀察擴(kuò)增效果。
（三）MgCl₂濃度不合適
Mg²⁺是 Taq 酶活性必需離子，濃度過高或過低，都會(huì)影響 Taq 酶活性和擴(kuò)增效率。濃度過高，可能增加非特異性擴(kuò)增；過低，Taq 酶活性受抑制。
解決辦法：依據(jù)所用 PCR 試劑盒推薦，適當(dāng)調(diào)整 MgCl₂濃度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度。
（四）PCR 產(chǎn)物過長
PCR 產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過 500bp，擴(kuò)增難度會(huì)增加，所需時(shí)間更長，導(dǎo)致 Ct 值過晚。因?yàn)殚L片段擴(kuò)增對反應(yīng)條件要求更嚴(yán)苛，容易出現(xiàn)擴(kuò)增效率低的問題。
解決辦法：重新設(shè)計(jì)引物，縮短 PCR 產(chǎn)物長度，一般控制在 100 - 300bp，更利于高效擴(kuò)增。
（五）模板中存在抑制物
模板提取過程中，若混入蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，這些物質(zhì)可能抑制 Taq 酶活性，降低擴(kuò)增效率，使 Ct 值過晚。
解決辦法：使用高純度模板進(jìn)行 PCR 檢測，或?qū)δ０暹M(jìn)行稀釋，降低抑制物濃度。也可采用模板純化試劑盒，進(jìn)一步去除雜質(zhì)。