熒光定量PCR實驗技巧

實時熒光定量 PCR（qPCR）是生命科學領域的革命性技術，能在 PCR 擴增過程中實時監測熒光信號，實現對靶基因的精確定量。熒光定量 PCR 已成為分子生物學領域的金標準技術，但其特異性優化仍是許多研究者面臨的挑戰。

然而，PCR 特異性問題始終困擾著許多研究人員。非特異性擴增不僅會導致實驗結果不準確，還會浪費寶貴的樣本和時間。本文將詳細介紹提高 PCR 特異性的九大方法，并結合最新市場數據，幫助您選擇適合的熒光定量 PCR 儀器和試劑。

一、引物設計：特異性擴增的基石

細心地進行引物設計是 PCR 中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。

引物設計的關鍵原則

• 長度適宜：典型的引物 18 到 24 個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，但大于 24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。

• GC 含量合理：選擇 GC 含量為 40％到 60％或 GC 含量映像模板 GC 含量的引物。設計 5' 端和中間區為 G 或 C 的引物，增加引物穩定性。

• 避免二聚體：避免引物對 3' 末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

• 3' 末端設計：避免 3' 末端富含 GC，保證在最后 5 個核苷中含有 3 個 A 或 T。避免 3' 末端的錯誤配對。

• 二級結構：避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。

使用 NCBI Primer-BLAST 工具進行引物設計，注意跨外顯子連接區設計，避免基因組 DNA 擴增。

二、引物退火溫度：精確控制的關鍵

熔解溫度（Tm）是當 50％的引物和互補序列表現為雙鏈 DNA 分子時的溫度。Tm 對于設定 PCR 退火溫度是必需的。

優化策略

• 合理的退火溫度從 55℃到 70℃，一般設定比引物的 Tm 低 5℃。

• 為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的 Tm 值（差異不超過 5℃）。

• 可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性，以 2℃為增量逐步提高退火溫度。

遞減 PCR 通過在 PCR 的前幾個循環使用嚴緊的退火條件提高特異性。循環開始在比估算的 Tm 高大約 5℃的退火溫度下開始，然后每個循環降低 1℃到 2℃，直到退火溫度低于 Tm 5℃。

這種方法只有同源性最高的目的模板會被擴增，這些產物在隨后的循環中繼續擴增，并會將擴增的非特異性產物排擠出去。

引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在 0.1 到 0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。

可以使用光吸收值和微摩消光系數的倒數（nmol/OD），通過 Beers 法則計算引物濃度。避免使用寡聚核苷酸作為標準在 EB 染色的膠上估算引物濃度，因為引物和標準的染色能力根據序列不同而差異很大。

定制引物的標準純度對于大多數 PCR 應用是足夠的。但部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。

引物保存建議

• 最好在 TE 重溶引物，使其最終濃度為 100μM。

• 將干粉和溶解的引物儲存在 - 20℃。

• 大于 10μM 濃度溶于 TE 的引物在 - 20℃可以穩定保存 6 個月。

• 干粉引物可以在 - 20℃保存至少 1 年。

熱啟動 PCR 是除了好的引物設計之外，提高 PCR 特異性最重要的方法之一。盡管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸溫度在 72℃，聚合酶在室溫仍然有活性，因此在進行 PCR 反應配制過程中會產生非特異性的產物。

Platinum Taq DNA 聚合酶對于自動熱啟動 PCR 來說方便高效。同經化學修飾用于熱啟動的 Taq DNA 聚合酶相比，Platinum 酶不需要在 94℃延時保溫（10 到 15 分鐘）以激活聚合酶。

鎂離子影響 PCR 的多個方面，如 DNA 聚合酶的活性，這會影響產量；再如引物退火，這會影響特異性。包含 200μM dNTP 的典型 PCR 起始濃度是 1.5mM（對實時定量 PCR，使用 3 到 5mM 帶有熒光探針的鎂離子溶液）。

為了確定最佳濃度，從 1mM 到 3mM，以 0.5mM 遞增，進行鎂離子滴定。Platinum Taq DNA 聚合酶能夠在比 Taq DNA 聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內保持功能，因此僅需較少的優化。

對于高 GC 含量的模板等困難模板，需要添加輔助物質。PCR 添加劑包括甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿以及 PCRx Enhancer Solution 可以增強擴增。

它們可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助 DNA 聚合酶延伸通過二級結構區。為獲得最佳結果，應優化添加劑的濃度，尤其是會抑制 Taq DNA 聚合酶的 DMSO、甲酰胺和甘油。

使用巢式引物進行連續多輪擴增可以顯著提高特異性和靈敏度。第一輪是 15 到 20 個循環的標準擴增，將一小部分起始擴增產物稀釋 100 到 1000 倍加入到第二輪擴增中進行 15 到 20 個循環。

在第二輪擴增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物內側的靶序列結合。巢式 PCR 的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同兩套引物都互補的靶序列很少。

實驗質量控制要點

為確保 qPCR 實驗結果可靠性，必須設置以下五種必要對照：

• NTC（無模板對照）：監測引物二聚體 / 體系污染。

• NRT（無逆轉錄對照）：檢測 gDNA 殘留。

• 陽性對照：確認反應體系有效性。

• 標準曲線：計算引物擴增效率。

• 內參對照：樣本間歸一化基準。

提高 PCR 特異性需要綜合考慮引物設計、反應條件優化和添加劑使用等多個方面。通過本文介紹的九種方法，您可以顯著提高 PCR 反應的特異性，獲得更加可靠實驗結果。

同時，選擇高質量的 PCR 儀器和試劑也是確保實驗結果重復性的重要因素。根據您的實驗需求和預算，選擇適合的熒光定量 PCR 儀，將有助于您獲得更加準確和可靠的實驗結果。