文獻(xiàn)解讀：PM2.5暴露通過m6A甲基化調(diào)控雄性生殖功能損傷機(jī)制
近日，陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系王建康博士和張中豪博士為并列第一作者、劉晉祎教授為唯一通訊作者，在《Environmental Pollution》期刊上發(fā)表了題為“WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure”的研究論文。研究主要從m6A修飾角度揭示了PM2.5暴露對雄性生殖功能損傷的作用及其潛在機(jī)制。作者通過建立實時PM2.5暴露的小鼠模型和GC-2spd細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露會導(dǎo)致精子發(fā)生上皮損傷、精子運動能力下降，并且通過改變睪丸組織中m6A修飾圖譜，尤其是影響Hmgb2基因的m6A修飾，進(jìn)而影響精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致精子活力降低。該研究不僅為理解PM2.5對男性生殖健康的危害提供新視角，還為未來開發(fā)靶向環(huán)境污染導(dǎo)致生殖損傷的干預(yù)措施提供了理論依據(jù)。
標(biāo)題：WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure（WTAP介導(dǎo)的Hmgb2 m6A修飾促進(jìn)PM2.5暴露誘導(dǎo)的精子發(fā)生損傷）
發(fā)表時間：2025年4月1日
發(fā)表期刊：Environmental Pollution
影響因子：IF7.3/Q1
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系王建康、張中豪、劉晉祎等
doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896
N6-甲基腺苷（m6A）廣泛參與復(fù)雜的精子發(fā)生過程，同時對環(huán)境暴露極為敏感。眾多研究表明，細(xì)顆粒物（PM2.5）對男性生殖系統(tǒng)具有毒性，但其中涉及的具體表觀遺傳機(jī)制尚未得到充分研究。本研究通過構(gòu)建實時PM2.5暴露的小鼠模型和GC-2spd細(xì)胞系，研究了m6A修飾對PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖功能障礙的影響。結(jié)果表明，PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮受損、精母細(xì)胞線粒體異常以及精子運動能力顯著下降。MeRIP-seq基因富集分析結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)PM2.5處理的小鼠睪丸組織中差異m6A修飾基因在精子發(fā)生過程中顯著富集，且甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP表達(dá)在PM2.5暴露后顯著降低。此外，PM2.5暴露導(dǎo)致精子發(fā)生相關(guān)基因Hmgb2表達(dá)以及Hmgb2 m6A修飾水平顯著降低。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）及驗證實驗表明，Hmgb2可能調(diào)控精母細(xì)胞中的ATP（腺苷三磷酸）水平。研究還證實m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP通過m6A修飾影響Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性。本研究為理解PM2.5對精子發(fā)生損害以及精子運動能力降低提供了新見解。
研究方法
動物實驗：8周齡實驗小鼠隨機(jī)分為三組，分別暴露于高濃度環(huán)境顆粒物（CAP，483.6μg/m³）、正常環(huán)境未過濾空氣（UA，59.8μg/m³）和過濾空氣（FA，0.4μg/m³）中，每組8只小鼠。暴露結(jié)束后，對小鼠睪丸進(jìn)行組織學(xué)檢查、精子運動能力檢測、超微結(jié)構(gòu)觀察等。
細(xì)胞實驗：使用小鼠來源的精母細(xì)胞（GC-2spd體外細(xì)胞系）進(jìn)行細(xì)胞實驗，將 PM2.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM1648a制備PM2.5股溶液（5mg/mL），選擇 0、25、50、100μg/mL 四個濃度的 PM2.5進(jìn)行細(xì)胞實驗。
基因敲低與過表達(dá)：分別對Wtap和Hmgb2進(jìn)行過表達(dá)和敲低操作。
轉(zhuǎn)錄組測序：對Hmgb2敲低的GC-2spd 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），分析RNA表達(dá)變化。
MeRIP-Seq：對睪丸組織的m6A RNA免疫沉淀測序，檢測不同組暴露小鼠的m6A甲基化水平變化。
特定位點m6A修飾檢測（MeRIP - qRT - PCR）：根據(jù) MeRIP-Seq結(jié)果設(shè)計特異性引物進(jìn)行 qRT - PCR 檢測特定位點 m6A修飾水平。
結(jié)果圖形
（1）PM2.5暴露導(dǎo)致精子細(xì)胞損傷和精子運動能力下降
研究者構(gòu)建了實時PM2.5暴露的小鼠模型，通過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮受損，表現(xiàn)為增加的空泡化和精子細(xì)胞排列紊亂（圖1A）。對VII期精子發(fā)生小管中的細(xì)胞計數(shù)顯示，PM2.5暴露后，粗線期精母細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而精原細(xì)胞和圓形精子數(shù)量雖有下降趨勢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，支持細(xì)胞數(shù)量未發(fā)生顯著變化（圖1B-E）。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，PM2.5暴露后，精母細(xì)胞線粒體受損，表現(xiàn)為線粒體嵴減少和外膜破裂（圖1F），提示精母細(xì)胞是PM2.5暴露的關(guān)鍵靶細(xì)胞。此外，通過計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）分析小鼠精子運動能力，與過濾空氣（FA）組相比，正常環(huán)境（UA）組精子運動能力相關(guān)參數(shù)（總精子運動能力、超激活、PR和VSL）呈現(xiàn)下降趨勢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，而高濃度環(huán)境顆粒物（CAP）組所有參數(shù)均顯著下降（圖1G-J）。這些結(jié)果表明PM2.5暴露對小鼠精子發(fā)生和運動能力產(chǎn)生了明顯負(fù)作用。
圖1：PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮損傷和精子運動能力下降。
A 睪丸組織HE染色切片的代表性圖像。
(B-E) VII期精子發(fā)生小管中的精子細(xì)胞計數(shù)，包括精原細(xì)胞（B）、粗線期精母細(xì)胞（C）、圓形精子（D）和Sertoli細(xì)胞（E）（n=8）。
(F) 睪丸超微結(jié)構(gòu)的代表性圖像。紅色箭頭線：受損的線粒體（嵴減少和外膜破裂）。
(G-J) 通過CASA測量的精子運動能力相關(guān)參數(shù)，包括總精子運動能力（G）、前向運動能力（PR，H）、直線速度（VSL，I）和精子超活化（J）（n=8）。
（2）PM2.5暴露誘導(dǎo)睪丸m6A甲基化圖譜變化
為深入了解m6A修飾在PM2.5誘導(dǎo)的雄性生殖損傷中的作用，研究者對睪丸組織細(xì)胞中的RNA m6A進(jìn)行高通量測序（MeRIP-seq）。在FA組中，m6A修飾基因主要在精子發(fā)生、精子與透明帶結(jié)合以及精子細(xì)胞發(fā)育等過程中富集，表明m6A修飾在正常雄性生殖過程中發(fā)揮功能（圖2A）。進(jìn)一步分析差異甲基化區(qū)域（DMRs，P<0.05），結(jié)果表明與FA組相比，CAP組有152個顯著上調(diào)甲基化區(qū)域和105個顯著下調(diào)甲基化區(qū)域，而UA組與FA組之間有298個上調(diào)區(qū)域和85個下調(diào)區(qū)域（圖2B）。這些DMRs主要位于mRNA結(jié)構(gòu)的CDS和3'UTR區(qū)域（圖2C）。對DMRs的motif分析顯示，CAP組和FA組的DMRs主要出現(xiàn)在HGACC等motif中，而UA組和FA組的DMRs主要出現(xiàn)在HCGAH等motif中（圖2D）。對CAP、UA和FA組中差異m6A修飾基因的功能富集分析顯示，精子發(fā)生過程顯著富集（圖2E和F）。這些結(jié)果表明m6A修飾可能參與PM2.5誘導(dǎo)的雄性生殖損傷過程。MeRIP-Seq技術(shù)在這一部分發(fā)揮關(guān)鍵作用，其對RNA上的m6A修飾進(jìn)行高通量測序，從而全面揭示PM2.5暴露后睪丸組織中m6A修飾的整體變化情況，為后續(xù)尋找關(guān)鍵靶基因提供基礎(chǔ)。
(B) 差異m6A修飾peaks分析。
(C) 差異甲基化區(qū)域（DMRs）在mRNA上的分布模式。
(D) DMRs的motif分析。（R=A/G，H=A/C/U）
(E-F) CAP組與FA組（E）以及UA組與FA組（F）中不同m6A修飾基因的生物過程富集分析。
（3）Hmgb2是一個關(guān)鍵的差異表達(dá)m6A修飾精子發(fā)生相關(guān)基因
研究者進(jìn)一步分析了FA、UA和CAP組之間的差異m6A修飾精子發(fā)生相關(guān)基因的交集，共鑒定出10個潛在關(guān)鍵基因（Hmgb2、Tdrd5、Hspa1l、Bag6、Setx、Pax5、Map7、Dnm2、Chd5和Piwil1）。對這些基因在小鼠睪丸中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗證分析，結(jié)果表明Hmgb2和Piwil1在PM2.5暴露小鼠睪丸中顯著下調(diào)，而Tdrd5顯著上調(diào)（圖3A）。在GC-2spd細(xì)胞中存在類似結(jié)果（圖3B）。HMGB2蛋白在PM2.5暴露小鼠睪丸中的表達(dá)顯著降低（圖3C和D），但在體外模型中，HMGB2蛋白水平在PM2.5處理后也顯著下調(diào)（圖3E和F）。MeRIP-Seq結(jié)果顯示，PM2.5暴露后睪丸組織中Hmgb2的m6A修飾減少（圖3G），這一結(jié)果在體外模型中也得到進(jìn)一步驗證（圖3H）�；谶@些數(shù)據(jù)，研究者將關(guān)注點聚焦于Hmgb2基因。MeRIP-Seq不僅能夠檢測到Hmgb2基因m6A修飾變化，還精確定位修飾發(fā)生的具體區(qū)域，為后續(xù)研究Hmgb2基因m6A修飾的功能提供重要依據(jù)。
(C) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白的表達(dá)。
(D) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細(xì)胞中HMGB2蛋白的表達(dá)。
(F) 細(xì)胞中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(G) 小鼠睪丸中Hmgb2 mRNA甲基化峰的可視化。
(H)通過MeRIP-qRT-PCR檢測PM2.5暴露對GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2 m6A修飾的作用（n=3）。
（4）Hmgb2下調(diào)介導(dǎo)小鼠精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP水平變化
Hmgb2在精子發(fā)生和精子運動能力中的具體功能尚不清楚。研究者構(gòu)建了Hmgb2敲低的GC-2spd細(xì)胞系并進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出199個差異表達(dá)基因（DEGs），包括145個上調(diào)基因和54個下調(diào)基因（圖4C）。對這些DEGs進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化通路顯著富集，GO富集分析顯示線粒體呼吸鏈復(fù)合體I顯著富集（圖4D和E）。這些結(jié)果表明Hmgb2可能參與精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP合成。ATP水解是真核細(xì)胞中代謝能量的主要來源，ATP檢測試驗顯示Hmgb2敲低后細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低（圖4F）。進(jìn)一步實驗結(jié)果表明，PM2.5暴露的GC-2spd細(xì)胞中ATP水平降低（圖4G）。通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組富集的氧化磷酸化基因在Hmgb2敲低和PM2.5處理的GC-2spd細(xì)胞中的表達(dá)確實受到干擾。研究者驗證了PM2.5誘導(dǎo)的ATP降低可以通過過表達(dá)Hmgb2來逆轉(zhuǎn)（圖4H和I）。這些數(shù)據(jù)表明Hmgb2可能調(diào)控精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP水平，從而影響精子運動能力。
(C) GC-2spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染siHMGB2后轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的火山圖。
(D) RNA-seq中差異表達(dá)基因的KEGG分析圖。
(E) RNA-seq的GO富集分析結(jié)果。
(F) siHMGB2處理后GC-2spd細(xì)胞中的ATP水平。
(G) PM2.5暴露后細(xì)胞中的ATP水平。
(H) HMGB2-OE質(zhì)粒處理后的HMGB2蛋白表達(dá)。
(I) 有無PM2.5處理時，HMGB2-OE質(zhì)粒處理后GC-2spd細(xì)胞中的ATP水平。
（5）PM2.5誘導(dǎo)的m6A修飾可能主要由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP下調(diào)引起
差異m6A修飾受m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控。為探索PM2.5暴露小鼠雄性生殖系統(tǒng)中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶是否差異表達(dá)，研究者檢測了甲基轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL4和WTAP）和去甲基轉(zhuǎn)移酶（FTO和ALKBH5）的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，PM2.5暴露小鼠睪丸中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP表達(dá)顯著降低，而PM2.5對m6A去甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)無影響（圖5A）。在PM2.5暴露的GC-2spd細(xì)胞中也得到一致結(jié)果（圖5B）。此外，WTAP蛋白在PM2.5暴露的睪丸組織和GC-2spd細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（圖5C-F）。同時，WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在很高的互作概率。
(C) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的表達(dá)。
(D) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細(xì)胞中WTAP蛋白的表達(dá)。
(F) GC-2spd細(xì)胞中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
（6）WTAP通過m6A修飾調(diào)控PM2.5誘導(dǎo)的Hmgb2表達(dá)降低
接下來，研究者進(jìn)一步確認(rèn)Hmgb2表達(dá)是否受甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP的調(diào)控。首先通過RNA免疫沉淀實驗（RIP）結(jié)果表明，與陰性對照IgG相比，抗WTAP抗體在Hmgb2中顯著富集（圖6A），表明WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在互作。使用siRNA敲低Wtap后，GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2 mRNA表達(dá)顯著降低，蛋白表達(dá)驗證結(jié)果也一致（圖6B-D）。為研究m6A修飾的具體調(diào)控作用，研究者進(jìn)行MeRIP-qRT-PCR實驗。根據(jù)MeRIP-Seq結(jié)果設(shè)計特異性引物，發(fā)現(xiàn)敲低Wtap導(dǎo)致Hmgb2的m6A修飾水平降低（圖6E）。進(jìn)一步構(gòu)建過表達(dá)Wtap的細(xì)胞系，結(jié)果顯示過表達(dá)Wtap后GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2的m6A修飾顯著提高（圖6F）。研究者還證明PM2.5誘導(dǎo)的Hmgb2降低可以通過過表達(dá)Wtap來逆轉(zhuǎn)（圖6G和H）。為驗證Wtap是否通過m6A修飾調(diào)控Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性，研究者進(jìn)行RNA穩(wěn)定性實驗。結(jié)果表明敲低Wtap加速Hmgb2 mRNA降解（圖6I）。總體而言，這些結(jié)果表明PM2.5誘導(dǎo)的Hmgb2低表達(dá)是由于WTAP通過m6A修飾調(diào)控的Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性降低所致。
(B) 轉(zhuǎn)染siWTAP后GC-2spd細(xì)胞中Wtap和Hmgb2 mRNA表達(dá)的驗證（n=3）。
(C) siWTAP處理后細(xì)胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達(dá)。
(D) siWTAP處理后WTAP和HMGB2蛋白表達(dá)的定量分析（n=3）。
(E) siWTAP-3處理對GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2的m6A修飾的影響（n=3）。
(F) Wtap過表達(dá)后GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2的m6A修飾水平（n=3）。
(G) 有無PM2.5處理時，對照組和WTAP-OEGC-2spd細(xì)胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達(dá)水平。
(H) WTAP和HMGB2蛋白的定量分析（n=3）。
(I) 與siNC組相比，有無siWTAP處理時GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2 mRNA的穩(wěn)定性（n=3）。
結(jié)論和啟示
本研究從m6A修飾的表觀遺傳學(xué)角度為理解PM2.5的雄性生殖毒性提供了新的視角。PM2.5暴露后，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP表達(dá)降低，導(dǎo)致Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性降低（通過降低Hmgb2的m6A修飾），進(jìn)而影響精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP水平，最終導(dǎo)致精子運動能力下降。本研究揭示了PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮受損和精子運動能力下降的現(xiàn)象，并闡明了m6A修飾在PM2.5暴露導(dǎo)致的精子發(fā)生細(xì)胞損傷中的作用。
MeRIP-Seq在本研究中的作用
本研究通過MeRIP-Seq技術(shù)全面揭示了PM2.5暴露對睪丸組織m6A修飾的影響，并進(jìn)一步通過實驗驗證了關(guān)鍵基因Hmgb2的m6A修飾變化及其功能。這一發(fā)現(xiàn)提示，在未來類似的污染環(huán)境暴露研究中，m6A修飾檢測技術(shù)（如MeRIP-Seq）可以作為一種強(qiáng)有力的工具，用于探索環(huán)境因素對生物體基因表達(dá)和生理功能的影響機(jī)制，為開發(fā)靶向干預(yù)措施提供理論依據(jù)。
參考文獻(xiàn)：
Wang J, Zhang Z, Shi F, Li Y, Shi C, Wang T, Sun L, Ao L, Han F, Chen Q, Cao J, Liu J. WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure. Environ Pollut. 2025 Feb 21:125896. doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896.
標(biāo)題：WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure（WTAP介導(dǎo)的Hmgb2 m6A修飾促進(jìn)PM2.5暴露誘導(dǎo)的精子發(fā)生損傷）
發(fā)表時間：2025年4月1日
發(fā)表期刊：Environmental Pollution
影響因子：IF7.3/Q1
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系王建康、張中豪、劉晉祎等
doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896
N6-甲基腺苷（m6A）廣泛參與復(fù)雜的精子發(fā)生過程，同時對環(huán)境暴露極為敏感。眾多研究表明，細(xì)顆粒物（PM2.5）對男性生殖系統(tǒng)具有毒性，但其中涉及的具體表觀遺傳機(jī)制尚未得到充分研究。本研究通過構(gòu)建實時PM2.5暴露的小鼠模型和GC-2spd細(xì)胞系，研究了m6A修飾對PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖功能障礙的影響。結(jié)果表明，PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮受損、精母細(xì)胞線粒體異常以及精子運動能力顯著下降。MeRIP-seq基因富集分析結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)PM2.5處理的小鼠睪丸組織中差異m6A修飾基因在精子發(fā)生過程中顯著富集，且甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP表達(dá)在PM2.5暴露后顯著降低。此外，PM2.5暴露導(dǎo)致精子發(fā)生相關(guān)基因Hmgb2表達(dá)以及Hmgb2 m6A修飾水平顯著降低。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）及驗證實驗表明，Hmgb2可能調(diào)控精母細(xì)胞中的ATP（腺苷三磷酸）水平。研究還證實m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP通過m6A修飾影響Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性。本研究為理解PM2.5對精子發(fā)生損害以及精子運動能力降低提供了新見解。
研究圖形摘要
研究方法
動物實驗：8周齡實驗小鼠隨機(jī)分為三組，分別暴露于高濃度環(huán)境顆粒物（CAP，483.6μg/m³）、正常環(huán)境未過濾空氣（UA，59.8μg/m³）和過濾空氣（FA，0.4μg/m³）中，每組8只小鼠。暴露結(jié)束后，對小鼠睪丸進(jìn)行組織學(xué)檢查、精子運動能力檢測、超微結(jié)構(gòu)觀察等。
細(xì)胞實驗：使用小鼠來源的精母細(xì)胞（GC-2spd體外細(xì)胞系）進(jìn)行細(xì)胞實驗，將 PM2.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM1648a制備PM2.5股溶液（5mg/mL），選擇 0、25、50、100μg/mL 四個濃度的 PM2.5進(jìn)行細(xì)胞實驗。
基因敲低與過表達(dá)：分別對Wtap和Hmgb2進(jìn)行過表達(dá)和敲低操作。
轉(zhuǎn)錄組測序：對Hmgb2敲低的GC-2spd 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），分析RNA表達(dá)變化。
MeRIP-Seq：對睪丸組織的m6A RNA免疫沉淀測序，檢測不同組暴露小鼠的m6A甲基化水平變化。
特定位點m6A修飾檢測（MeRIP - qRT - PCR）：根據(jù) MeRIP-Seq結(jié)果設(shè)計特異性引物進(jìn)行 qRT - PCR 檢測特定位點 m6A修飾水平。
結(jié)果圖形
（1）PM2.5暴露導(dǎo)致精子細(xì)胞損傷和精子運動能力下降
研究者構(gòu)建了實時PM2.5暴露的小鼠模型，通過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮受損，表現(xiàn)為增加的空泡化和精子細(xì)胞排列紊亂（圖1A）。對VII期精子發(fā)生小管中的細(xì)胞計數(shù)顯示，PM2.5暴露后，粗線期精母細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而精原細(xì)胞和圓形精子數(shù)量雖有下降趨勢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，支持細(xì)胞數(shù)量未發(fā)生顯著變化（圖1B-E）。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，PM2.5暴露后，精母細(xì)胞線粒體受損，表現(xiàn)為線粒體嵴減少和外膜破裂（圖1F），提示精母細(xì)胞是PM2.5暴露的關(guān)鍵靶細(xì)胞。此外，通過計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）分析小鼠精子運動能力，與過濾空氣（FA）組相比，正常環(huán)境（UA）組精子運動能力相關(guān)參數(shù)（總精子運動能力、超激活、PR和VSL）呈現(xiàn)下降趨勢，但差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，而高濃度環(huán)境顆粒物（CAP）組所有參數(shù)均顯著下降（圖1G-J）。這些結(jié)果表明PM2.5暴露對小鼠精子發(fā)生和運動能力產(chǎn)生了明顯負(fù)作用。
圖1：PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮損傷和精子運動能力下降。
(B-E) VII期精子發(fā)生小管中的精子細(xì)胞計數(shù)，包括精原細(xì)胞（B）、粗線期精母細(xì)胞（C）、圓形精子（D）和Sertoli細(xì)胞（E）（n=8）。
(F) 睪丸超微結(jié)構(gòu)的代表性圖像。紅色箭頭線：受損的線粒體（嵴減少和外膜破裂）。
(G-J) 通過CASA測量的精子運動能力相關(guān)參數(shù)，包括總精子運動能力（G）、前向運動能力（PR，H）、直線速度（VSL，I）和精子超活化（J）（n=8）。
（2）PM2.5暴露誘導(dǎo)睪丸m6A甲基化圖譜變化
為深入了解m6A修飾在PM2.5誘導(dǎo)的雄性生殖損傷中的作用，研究者對睪丸組織細(xì)胞中的RNA m6A進(jìn)行高通量測序（MeRIP-seq）。在FA組中，m6A修飾基因主要在精子發(fā)生、精子與透明帶結(jié)合以及精子細(xì)胞發(fā)育等過程中富集，表明m6A修飾在正常雄性生殖過程中發(fā)揮功能（圖2A）。進(jìn)一步分析差異甲基化區(qū)域（DMRs，P<0.05），結(jié)果表明與FA組相比，CAP組有152個顯著上調(diào)甲基化區(qū)域和105個顯著下調(diào)甲基化區(qū)域，而UA組與FA組之間有298個上調(diào)區(qū)域和85個下調(diào)區(qū)域（圖2B）。這些DMRs主要位于mRNA結(jié)構(gòu)的CDS和3'UTR區(qū)域（圖2C）。對DMRs的motif分析顯示，CAP組和FA組的DMRs主要出現(xiàn)在HGACC等motif中，而UA組和FA組的DMRs主要出現(xiàn)在HCGAH等motif中（圖2D）。對CAP、UA和FA組中差異m6A修飾基因的功能富集分析顯示，精子發(fā)生過程顯著富集（圖2E和F）。這些結(jié)果表明m6A修飾可能參與PM2.5誘導(dǎo)的雄性生殖損傷過程。MeRIP-Seq技術(shù)在這一部分發(fā)揮關(guān)鍵作用，其對RNA上的m6A修飾進(jìn)行高通量測序，從而全面揭示PM2.5暴露后睪丸組織中m6A修飾的整體變化情況，為后續(xù)尋找關(guān)鍵靶基因提供基礎(chǔ)。
圖2：CAP、UA和FA組睪丸轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的差異m6A甲基化特征。
(A) FA組中m6A修飾基因的基因本體（GO）富集分析。(B) 差異m6A修飾peaks分析。
(C) 差異甲基化區(qū)域（DMRs）在mRNA上的分布模式。
(D) DMRs的motif分析。（R=A/G，H=A/C/U）
(E-F) CAP組與FA組（E）以及UA組與FA組（F）中不同m6A修飾基因的生物過程富集分析。
（3）Hmgb2是一個關(guān)鍵的差異表達(dá)m6A修飾精子發(fā)生相關(guān)基因
研究者進(jìn)一步分析了FA、UA和CAP組之間的差異m6A修飾精子發(fā)生相關(guān)基因的交集，共鑒定出10個潛在關(guān)鍵基因（Hmgb2、Tdrd5、Hspa1l、Bag6、Setx、Pax5、Map7、Dnm2、Chd5和Piwil1）。對這些基因在小鼠睪丸中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗證分析，結(jié)果表明Hmgb2和Piwil1在PM2.5暴露小鼠睪丸中顯著下調(diào)，而Tdrd5顯著上調(diào)（圖3A）。在GC-2spd細(xì)胞中存在類似結(jié)果（圖3B）。HMGB2蛋白在PM2.5暴露小鼠睪丸中的表達(dá)顯著降低（圖3C和D），但在體外模型中，HMGB2蛋白水平在PM2.5處理后也顯著下調(diào)（圖3E和F）。MeRIP-Seq結(jié)果顯示，PM2.5暴露后睪丸組織中Hmgb2的m6A修飾減少（圖3G），這一結(jié)果在體外模型中也得到進(jìn)一步驗證（圖3H）�；谶@些數(shù)據(jù)，研究者將關(guān)注點聚焦于Hmgb2基因。MeRIP-Seq不僅能夠檢測到Hmgb2基因m6A修飾變化，還精確定位修飾發(fā)生的具體區(qū)域，為后續(xù)研究Hmgb2基因m6A修飾的功能提供重要依據(jù)。
圖3：PM2.5暴露后GC-2spd細(xì)胞和睪丸中Hmgb2表達(dá)下調(diào)。
(A-B) 小鼠睪丸（A）和GC-2spd細(xì)胞（B）中10個關(guān)鍵差異m6A修飾的精子發(fā)生相關(guān)基因mRNA表達(dá)（n=3）。(C) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白的表達(dá)。
(D) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細(xì)胞中HMGB2蛋白的表達(dá)。
(F) 細(xì)胞中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(G) 小鼠睪丸中Hmgb2 mRNA甲基化峰的可視化。
(H)通過MeRIP-qRT-PCR檢測PM2.5暴露對GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2 m6A修飾的作用（n=3）。
（4）Hmgb2下調(diào)介導(dǎo)小鼠精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP水平變化
Hmgb2在精子發(fā)生和精子運動能力中的具體功能尚不清楚。研究者構(gòu)建了Hmgb2敲低的GC-2spd細(xì)胞系并進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出199個差異表達(dá)基因（DEGs），包括145個上調(diào)基因和54個下調(diào)基因（圖4C）。對這些DEGs進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化通路顯著富集，GO富集分析顯示線粒體呼吸鏈復(fù)合體I顯著富集（圖4D和E）。這些結(jié)果表明Hmgb2可能參與精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP合成。ATP水解是真核細(xì)胞中代謝能量的主要來源，ATP檢測試驗顯示Hmgb2敲低后細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低（圖4F）。進(jìn)一步實驗結(jié)果表明，PM2.5暴露的GC-2spd細(xì)胞中ATP水平降低（圖4G）。通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組富集的氧化磷酸化基因在Hmgb2敲低和PM2.5處理的GC-2spd細(xì)胞中的表達(dá)確實受到干擾。研究者驗證了PM2.5誘導(dǎo)的ATP降低可以通過過表達(dá)Hmgb2來逆轉(zhuǎn)（圖4H和I）。這些數(shù)據(jù)表明Hmgb2可能調(diào)控精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP水平，從而影響精子運動能力。
圖4：Hmgb2調(diào)控GC-2spd細(xì)胞中的ATP水平。
(A-B) 對照組和轉(zhuǎn)染siHMGB2的細(xì)胞中HMGB2蛋白的表達(dá)及定量分析（n=3）。(C) GC-2spd細(xì)胞轉(zhuǎn)染siHMGB2后轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的火山圖。
(D) RNA-seq中差異表達(dá)基因的KEGG分析圖。
(E) RNA-seq的GO富集分析結(jié)果。
(F) siHMGB2處理后GC-2spd細(xì)胞中的ATP水平。
(G) PM2.5暴露后細(xì)胞中的ATP水平。
(H) HMGB2-OE質(zhì)粒處理后的HMGB2蛋白表達(dá)。
(I) 有無PM2.5處理時，HMGB2-OE質(zhì)粒處理后GC-2spd細(xì)胞中的ATP水平。
（5）PM2.5誘導(dǎo)的m6A修飾可能主要由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP下調(diào)引起
差異m6A修飾受m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控。為探索PM2.5暴露小鼠雄性生殖系統(tǒng)中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶是否差異表達(dá)，研究者檢測了甲基轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL4和WTAP）和去甲基轉(zhuǎn)移酶（FTO和ALKBH5）的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，PM2.5暴露小鼠睪丸中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP表達(dá)顯著降低，而PM2.5對m6A去甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)無影響（圖5A）。在PM2.5暴露的GC-2spd細(xì)胞中也得到一致結(jié)果（圖5B）。此外，WTAP蛋白在PM2.5暴露的睪丸組織和GC-2spd細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（圖5C-F）。同時，WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在很高的互作概率。
圖5：PM2.5暴露后GC-2spd細(xì)胞和睪丸中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)檢測。
(A-B) 小鼠睪丸（A）和GC-2spd細(xì)胞（B）中甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA表達(dá)（n=3）。(C) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的表達(dá)。
(D) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細(xì)胞中WTAP蛋白的表達(dá)。
(F) GC-2spd細(xì)胞中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
（6）WTAP通過m6A修飾調(diào)控PM2.5誘導(dǎo)的Hmgb2表達(dá)降低
接下來，研究者進(jìn)一步確認(rèn)Hmgb2表達(dá)是否受甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP的調(diào)控。首先通過RNA免疫沉淀實驗（RIP）結(jié)果表明，與陰性對照IgG相比，抗WTAP抗體在Hmgb2中顯著富集（圖6A），表明WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在互作。使用siRNA敲低Wtap后，GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2 mRNA表達(dá)顯著降低，蛋白表達(dá)驗證結(jié)果也一致（圖6B-D）。為研究m6A修飾的具體調(diào)控作用，研究者進(jìn)行MeRIP-qRT-PCR實驗。根據(jù)MeRIP-Seq結(jié)果設(shè)計特異性引物，發(fā)現(xiàn)敲低Wtap導(dǎo)致Hmgb2的m6A修飾水平降低（圖6E）。進(jìn)一步構(gòu)建過表達(dá)Wtap的細(xì)胞系，結(jié)果顯示過表達(dá)Wtap后GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2的m6A修飾顯著提高（圖6F）。研究者還證明PM2.5誘導(dǎo)的Hmgb2降低可以通過過表達(dá)Wtap來逆轉(zhuǎn)（圖6G和H）。為驗證Wtap是否通過m6A修飾調(diào)控Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性，研究者進(jìn)行RNA穩(wěn)定性實驗。結(jié)果表明敲低Wtap加速Hmgb2 mRNA降解（圖6I）。總體而言，這些結(jié)果表明PM2.5誘導(dǎo)的Hmgb2低表達(dá)是由于WTAP通過m6A修飾調(diào)控的Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性降低所致。
圖6：WTAP通過m6A修飾調(diào)控Hmgb2 mRNA的穩(wěn)定性。
(A) 通過RNA免疫沉淀（RIP）分析WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA的互作（n=3）。(B) 轉(zhuǎn)染siWTAP后GC-2spd細(xì)胞中Wtap和Hmgb2 mRNA表達(dá)的驗證（n=3）。
(C) siWTAP處理后細(xì)胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達(dá)。
(D) siWTAP處理后WTAP和HMGB2蛋白表達(dá)的定量分析（n=3）。
(E) siWTAP-3處理對GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2的m6A修飾的影響（n=3）。
(F) Wtap過表達(dá)后GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2的m6A修飾水平（n=3）。
(G) 有無PM2.5處理時，對照組和WTAP-OEGC-2spd細(xì)胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達(dá)水平。
(H) WTAP和HMGB2蛋白的定量分析（n=3）。
(I) 與siNC組相比，有無siWTAP處理時GC-2spd細(xì)胞中Hmgb2 mRNA的穩(wěn)定性（n=3）。
結(jié)論和啟示
本研究從m6A修飾的表觀遺傳學(xué)角度為理解PM2.5的雄性生殖毒性提供了新的視角。PM2.5暴露后，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP表達(dá)降低，導(dǎo)致Hmgb2 mRNA穩(wěn)定性降低（通過降低Hmgb2的m6A修飾），進(jìn)而影響精子發(fā)生細(xì)胞中的ATP水平，最終導(dǎo)致精子運動能力下降。本研究揭示了PM2.5暴露導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生上皮受損和精子運動能力下降的現(xiàn)象，并闡明了m6A修飾在PM2.5暴露導(dǎo)致的精子發(fā)生細(xì)胞損傷中的作用。
MeRIP-Seq在本研究中的作用
本研究通過MeRIP-Seq技術(shù)全面揭示了PM2.5暴露對睪丸組織m6A修飾的影響，并進(jìn)一步通過實驗驗證了關(guān)鍵基因Hmgb2的m6A修飾變化及其功能。這一發(fā)現(xiàn)提示，在未來類似的污染環(huán)境暴露研究中，m6A修飾檢測技術(shù)（如MeRIP-Seq）可以作為一種強(qiáng)有力的工具，用于探索環(huán)境因素對生物體基因表達(dá)和生理功能的影響機(jī)制，為開發(fā)靶向干預(yù)措施提供理論依據(jù)。
參考文獻(xiàn)：
Wang J, Zhang Z, Shi F, Li Y, Shi C, Wang T, Sun L, Ao L, Han F, Chen Q, Cao J, Liu J. WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure. Environ Pollut. 2025 Feb 21:125896. doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896.
標(biāo)簽：
RNA甲基化修飾
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