單細胞和空間轉錄組學揭示驅動肉芽腫形成的異常淋巴發育程序

關鍵技術
scRNA-seq、ST-seq、Total seq

實驗結果
1. 巨噬細胞、T細胞和成纖維細胞是皮膚肉芽腫的主要細胞類型
為研究肉芽腫的細胞組成和基因調控，對12名皮膚結節病患者的病變和非病變皮膚活檢樣本進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）（Fig1A）。得到56000個細胞，通過注釋得到淋巴細胞、髓系細胞、角質形成細胞等八種主要的細胞類型（Fig 1B），并發現病變皮膚與非病變皮膚相比存在廣泛的轉錄變化（Fig 1C）。為繪制肉芽腫的組織背景，對所有12名患者的皮膚活檢樣本進行了空間轉錄組學和免疫熒光蛋白染色（Fig1A）。利用從scRNA-seq數據中獲得的基因特征，將空間轉錄組學特征分解為病變和非病變皮膚區域（Fig1D）。免疫熒光識別出CD3+ T細胞、CD68+巨噬細胞和CD90+成纖維細胞是肉芽腫內的主要細胞類型（Fig1E），這證實并擴展了的scRNA-seq數據分析。
 

Fig 1

2. 特異性巨噬細胞、T細胞和成纖維細胞亞群在肉芽腫中聚集
根據轉錄相似性識別出20個細胞簇，并根據marker基因的表達進行標記，在病變和非病變皮膚中觀察到7個非免疫細胞群和13個免疫細胞群（Fig 2A-B）。其中病變巨噬細胞、病變輔助T細胞和病變成纖維細胞幾乎僅在病變皮膚中發現其（Fig 2C）。為評估細胞亞群的定位，對空間轉錄組學數據進行了分析，得到四個群（Fig 2D）。并從組織學角度將這些群注釋為肉芽腫性真皮、未受影響的真皮和表皮；結合單細胞數據分析顯示，病變亞群的巨噬細胞、輔助T細胞和成纖維細胞主要存在于肉芽腫性真皮群中，而非病變亞群則存在于未受影響的真皮群中（Fig2E-F）。將病變和非病變巨噬細胞、輔助T細胞和成纖維細胞的基因表達譜映射到所有樣本的空間轉錄組學譜上，進一步證實了這一觀察結果，病變基因集在肉芽腫內部表現出高活性，而非病變基因集主要在周圍的真皮中表達（Fig2G）。
 

Fig 2

3. GA巨噬細胞顯示出強烈的促炎信號
為研究皮膚肉芽腫中巨噬細胞的作用，對所有巨噬細胞進行了降維和無監督聚類分析，得出了兩個主要亞群。cluster 0中的細胞與病變皮膚相關，而cluster 1群中的細胞主要來源于非病變皮膚；差異分析揭示cluster 0中髓系細胞的慢性激活轉錄譜，將cluster 0群相關的髓系細胞稱為“肉芽腫相關（GA）巨噬細胞”，并將1群中的細胞稱為“穩態巨噬細胞”（Fig 3A-B）。GA巨噬細胞高表達ACE、CHI3L1、CHIT1、CYP27A1、S100A8、IFNGR1及多種與IFN-γ激活、溶酶體功能、細胞外基質和代謝相關的基因，表現出一種非典型、促炎且代謝活躍的巨噬細胞表型（Fig3B）。為進一步表征GA巨噬細胞，重新聚類了所有巨噬細胞，并識別出兩個病變亞群：GA巨噬細胞群GA0和GA1（Fig3C）。GA0巨噬細胞高表達與結節病相關的基因以及金屬蛋白酶，而這些基因在GA1巨噬細胞中表達下調；同時，GA0巨噬細胞的基因特征被特異性定位到結節病肉芽腫區域，提示GA0巨噬細胞在肉芽腫形成和維持中發揮關鍵作用（Fig3D-F）。GA0巨噬細胞高表達編碼巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）的CSF1基因，這是巨噬細胞生存、分化和增殖的關鍵因子，可以分泌M-CSF，從而增加局部組織炎癥，并與CHIT1、CCL20、IL23A、MMP12和DCSTAMP等炎癥相關基因的表達升高密切相關，提示GA0巨噬細胞具備促進炎癥反應、細胞遷移和多核巨細胞形成的能力（Fig3G）。
 

Fig 3

4. 具有Th17.1表型的T細胞在肉芽腫中富集
將淋巴細胞細分，識別出包括輔助性T細胞、調節性T細胞、細胞毒性CD8 T細胞和NK細胞等七種淋巴細胞；cluster 0的輔助性T細胞包括病變和非病變皮膚細胞，而cluster 1的細胞主要來自病變皮膚（Fig4A）。將cluster 0稱為穩態輔助性T細胞，將cluster 1稱為GA輔助性T細胞，構成了一個肉芽腫特異性的細胞亞群。GA輔助性T細胞表現出慢性激活的Th17.1表型，由IL-23和IL-12驅動，產生大量IFN-γ和GM-CSF激活髓系細胞（Fig4B），并共表達轉錄因子T-bet和RORγt（Fig4C-D）。此外，Th17.1細胞通過CCL20-CCR6軸被招募至炎癥部位，其中CCL20由髓系細胞產生，而CCR6則表達在T細胞表面（Fig4B）。免疫熒光蛋白染色進一步證實，在肉芽腫內部定位的CD3+ T細胞上表達CCR6（Fig4E）。
 

Fig 4

5. 結構細胞促進肉芽腫局部炎癥和組織重塑
成纖維細胞識別出三個群，Cluster 0主要與非病變皮膚相關，稱為“穩態成纖維細胞”，cluster1主要由病變皮膚組成，稱為“GA成纖維細胞”，cluster2則包含來自兩種來源的細胞混合（Fig5A）。GA成纖維細胞高表達促炎基因OSMR及慢性炎癥相關標記FAP、PDPN和THY1，并表現出比穩態成纖維細胞更高的細胞異質性，主要由于其包含兩個功能不同的亞群；“免疫相互作用成纖維細胞”高表達細胞招募、抗原呈遞和TGF-β信號相關基因；“組織重塑成纖維細胞”則高表達細胞外基質（ECM）成分、基質調節和血管生成相關基因（Fig5B-C）。GA成纖維細胞在肉芽腫附近高表達促炎標記物FAP，其中免疫相互作用成纖維細胞位于肉芽腫周圍，而組織重塑成纖維細胞主要位于肉芽腫內部，提示ECM成分在肉芽腫內被分泌（Fig5D）。為識別有助于肉芽腫形成的成纖維細胞中的轉錄調節因子，將GA成纖維細胞與穩態成纖維細胞進行了比較，GA成纖維細胞高表達免疫相關轉錄因子（如IRF8、RELB、STAT2等）以及發育和IFN反應相關轉錄因子（如HOXC6、IRF5等），這些轉錄因子有助于在皮膚肉芽腫中觀察到的天然免疫樣功能和炎癥表型，提示成纖維細胞在肉芽腫形成中發揮免疫調節和組織重塑作用（Fig5D-E）。
 

Fig 5

6. 提示其在肉芽腫形成中發揮免疫調節和組織重塑作用
為理解細胞類型在肉芽腫形成中的相互作用，基于配體-受體表達預測細胞間的相互作用分析細胞間的通信。在肉芽腫內，GA輔助性T細胞通過表達IFNG作用于巨噬細胞和結構細胞上的IFNGR1，同時表達LTB與巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞上的LTBR結合，促進血管生成和ECM重塑（Fig6A）�？臻g轉錄組學數據進一步揭示了肉芽腫內部存在多種細胞間的配體-受體相互作用，包括趨化因子及其受體、細胞因子及其受體等，如內皮細胞表達的PECAM1（CD31）與肉芽腫內GA巨噬細胞和T細胞表達的CD38之間存在相互作用（Fig6B），免疫熒光蛋白染色證實（Fig6C）。此外，成纖維細胞、T細胞和內皮細胞表達多種整合素（如ITGA4、CD44），與ECM等成分（如FN1、SPP1）結合，介導免疫細胞的黏附和遷移（Fig6D）。免疫熒光蛋白染色驗證了整合素與ECM成分（如SPP1-CD44和FN1-α4β1）之間的相互作用，進一步支持分子在肉芽腫內免疫細胞遷移和黏附中的作用（Fig6E）。
 

Fig 6

7. 肉芽腫與TLS具有共同的關鍵特征
本研究揭示了肉芽腫與三級淋巴結構（TLS）的相似性，TLS在非淋巴組織中形成，有助于有效的免疫反應（Fig7A）。通過研究一個包含12種趨化因子的TLS特征，發現這些趨化因子在肉芽腫中高度表達（Fig7B-C）。具體來說，CCL5、CXCL9和CXCL10在GA巨噬細胞中上調，CCL4和CCL5在GA T細胞中上調，而CCL5、CCL19、CXCL9、CXCL10以及CXCL11在GA成纖維細胞中上調（Fig7D）。此外，肉芽腫中CCL19-CCR7/CXCR3通路特異性激活，參與T細胞向淋巴器官的歸巢（Fig7E）。通過使用另外兩個TLS特征進行驗證，發現肉芽腫與TLS之間高度相似。然而，肉芽腫中的輔助性T細胞促進巨噬細胞激活，而不是像在癌癥中觀察到的那樣減弱炎癥。因此，肉芽腫形成是一種失調和異常的淋巴器官形式，利用類似的調控機制，但未能重現生理正常TLSs的嚴格控制。最后，使用小鼠肉芽腫形成模型，通過藥物FPA-014靶向基質金屬蛋白酶MMP12，發現用MMP12抑制劑FPA-014治療小鼠4周后，與對照治療相比，肉芽腫誘導的四肢和尾部皮膚腫脹顯著減少（Fig7F）。這些結果支持基質金屬蛋白酶在肉芽腫形成和維持中的功能貢獻，這可能是通過其作為細胞外基質調節劑和免疫細胞激活劑的作用介導的。
 

Fig 7

結語
本研究整合單細胞轉錄組、空間轉錄組與免疫染色，系統繪制皮膚結節病肉芽腫的細胞-分子圖譜，發現巨噬細胞通過糖酵解-氧化磷酸化重編程及mTOR信號上調、凋亡下調維持慢性炎癥；輔助性T細胞呈現Th17.1表型，分泌IFN-γ、GM-CSF和LTB持續激活免疫；兩類成纖維細胞中，免疫相互作用亞群充當“非造血免疫細胞”招募并保留免疫細胞，組織重塑亞群則與巨噬細胞協同驅動ECM重構。肉芽腫在趨化因子譜與空間組織上高度類似三級淋巴結構，卻缺乏自限機制而成為慢性異常淋巴器官�？缙鞴衮炞C顯示關鍵調控基因共享，靶向MMP12的小鼠實驗證實可抑制肉芽腫形成。綜上，肉芽腫由免疫代謝重編程、細胞因子-趨化因子網絡及ECM-整合素調控三軸驅動，為結節病等非感染性肉芽腫的精準干預提供了分子框架與候選靶點。

參考文獻：
Krausgruber T, Redl A, Barreca D, et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal aberrant lymphoid developmental programs driving granuloma formation. Immunity. 2023 Feb 14;56(2):289-306.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2023.01.014. Epub 2023 Feb 6. PMID: 36750099; PMCID: PMC9942876.