深度解析CRISPR文庫篩選流程及應用案例

在生命科學領域，基因功能的研究和探索始終是前沿熱點。CRISPR文庫篩選技術作為一種強大的基因編輯和功能研究工具，正不斷推動著該領域的發展。

CRISPR文庫篩選思路
CRISPR文庫篩選是一種基于CRISPR-Cas9技術的強大基因編輯方法，旨在高效地篩選和研究細胞中特定基因的功能。通過構建大規模的sgRNA文庫來引入目標基因突變，研究人員觀察它們對細胞行為或表型的影響，從而揭示基因在生命過程中的作用和機制。

與傳統的基因研究方法相比，CRISPR篩選技術能夠批量篩選差異基因的功能，大大縮小研究范圍，提高研究效率，使得高通量基因功能研究成為可能。

CRISPR文庫篩選流程
CRISPR sgRNA文庫是高通量篩選靶基因的重要工具，可用于大規模或全基因組功能篩選，涉及信號通路、疾病、細胞藥物應答、發育、基因調控等方面。

1. sgRNA文庫設計與構建

• 設計：根據目標基因組，設計覆蓋全基因組或特定基因集的sgRNA序列，設計時需考慮GC含量（40%-80%）、長度（17-24個核苷酸）、脫靶效應等因素。每個基因通常設計多個sgRNA，以確保敲除效率。
• 合成：使用芯片合成技術，合成大量的sgRNA序列，并將其克隆到表達載體中。
• 文庫構建：將合成的sgRNA序列構建到CRISPR-Cas9表達載體中，形成sgRNA文庫。

2. 細胞轉染與篩選

• 轉染：將sgRNA文庫轉染到目標細胞系中，通常使用慢病毒或腺相關病毒（AAV）載體，確保高效率的轉染。
• 篩選：根據實驗設計，對轉染后的細胞進行功能篩選。例如，通過藥物處理篩選耐藥細胞，或通過流式細胞術篩選特定表型的細胞。

3. 測序與數據分析

• 測序：提取篩選各組細胞的基因組DNA，對細胞群體內的sgRNA序列進行特異性PCR和高通量測序，sgRNA種類和豐度變化。

4.驗證與功能研究

• 驗證：對篩選出的候選基因進行獨立驗證，確認其功能。
• 功能研究：進一步研究候選基因的生物學功能，探索其在疾病發生和發展中的作用。

CRISPR文庫篩選流程

1. 通過CRISPR文庫篩選確定HIV宿主依賴因子
HIV在感染和復制過程中，依賴宿主細胞內的多種因子，確定這些宿主依賴因子，對開發新型抗HIV療法意義重大。研究團隊通過構建覆蓋人類全基因組的CRISPR文庫，該文庫能對幾乎所有基因進行精準編輯，敲除或干擾特定基因的功能。將文庫導入被HIV感染的細胞系中，讓CRISPR系統發揮作用，使細胞內不同基因的功能發生改變。經過多輪篩選和深度測序分析，研究人員發現一組數量有限但關鍵的HIV宿主依賴因子。這些因子參與多個重要細胞通路，進一步研究表明，通過抑制其中某些關鍵因子的功能，可有效降低HIV在細胞內的復制水平，在體外實驗中展現出良好的抗HIV效果。

本研究利用全基因組CRISPR篩選技術，成功確定一系列HIV宿主依賴因子，揭示了HIV感染細胞的新機制，這為開發新型抗HIV藥物提供極具潛力的靶點，為攻克艾滋病難題帶來新的希望。

 針對HIV宿主依賴因子（HDFs）的全基因組CRISPR聯合篩選

2. 通過CRISPR文庫篩選解析原代免疫細胞調控網絡
免疫系統在維持人體健康方面發揮著關鍵作用，免疫細胞（如樹突狀細胞Dendritic Cells）在識別和響應病原體時，依賴于復雜的基因調控網絡。然而，傳統的基因功能研究方法在原代免疫細胞中難以實現高效和高通量的篩選。研究團隊利用全基因組CRISPR篩選技術，通過構建覆蓋全基因組的CRISPR文庫，靶向小鼠基因組中的約20,000個基因，實現對特定基因的功能缺失或改變。成功鑒定出多個在樹突狀細胞免疫反應中起重要作用的基因，包括已知的免疫相關基因（如Tlr4、Myd88）和許多先前未被充分研究的新基因。研究人員進一步解析樹突狀細胞在響應LPS時的信號傳導網絡，揭示多個新的調控節點，為理解免疫細胞的調控機制提供新的視角。

該研究利用全基因組CRISPR篩選技術，系統地分析原代免疫細胞中的基因調控網絡，為深入理解免疫細胞的功能調控機制提供重要線索。這不僅有助于揭示免疫相關疾病的發病機制，還為開發基于免疫調節的新型治療方法提供了潛在的藥物靶點和理論依據。

 在小鼠原代DC中進行全基因組匯集CRISPR篩選

3. 通過CRISPRi文庫篩選研究細菌必需基因功能
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種廣泛研究的模式微生物，具有重要的工業和生物學價值。為了系統性地分析枯草芽孢桿菌中的必需基因，研究團隊設計一個針對枯草芽孢桿菌必需基因的CRISPRi文庫，涵蓋約4000個基因。通過CRISPRi技術，研究人員能夠精確地敲低每個基因的表達，從而觀察其對細菌生長的影響。這種方法不僅能夠識別出哪些基因是細菌生存所必需的，還能夠揭示這些基因在細菌代謝、細胞壁合成、DNA復制等關鍵生物過程中的具體功能。

研究結果表明，CRISPRi文庫篩選能夠有效地識別出枯草芽孢桿菌中的必需基因，并且提供了這些基因在細菌生理過程中的詳細功能信息。此外，該研究還發現了一些先前未被充分研究的基因在細菌生長中的重要作用，為進一步研究細菌生物學和開發新型抗生素提供了新的靶點。

枯草芽孢桿菌必需基因功能的綜合分析 

References
[1] Peters JM, Colavin A, Shi H, Czarny TL, Larson MH, Wong S, Hawkins JS, Lu CHS, Koo BM, Marta E, Shiver AL, Whitehead EH, Weissman JS, Brown ED, Qi LS, Huang KC, Gross CA. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 2016 Jun 2;165(6):1493-1506.
[2] Park RJ, Wang T, Koundakjian D, Hultquist JF, Lamothe-Molina P, Monel B, Schumann K, Yu H, Krupzcak KM, Garcia-Beltran W, Piechocka-Trocha A, Krogan NJ, Marson A, Sabatini DM, Lander ES, Hacohen N, Walker BD. A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors. Nat Genet. 2017 Feb;49(2):193-203. 
[3] Parnas O, Jovanovic M, Eisenhaure TM, Herbst RH, Dixit A, Ye CJ, Przybylski D, Platt RJ, Tirosh I, Sanjana NE, Shalem O, Satija R, Raychowdhury R, Mertins P, Carr SA, Zhang F, Hacohen N, Regev A. A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks. Cell. 2015 Jul 30;162(3):675-86.