熒光定量PCR熔解曲線探針法的原理及應用

   
熔解曲線探針法是一種利用特異性探針結合到目標DNA序列上的技術，通過監測探針與目標DNA結合狀態的溫度依賴性變化，來識別和定量特定的DNA或RNA序列。

這種方法的關鍵在于探針與目標序列完全匹配時，其熔解溫度（Tm值）較高；而存在單核苷酸多態性（SNPs）或其他變異時，Tm值會下降。通過比較不同樣本的熔解曲線，可以精確地識別序列差異。

一、基本原理

熔解曲線探針法的原理

在實時熒光定量PCR（qPCR）實驗中，當雙鏈DNA受熱時，其互補堿基之間的氫鍵逐漸斷裂，導致雙鏈分離成兩條單鏈，這一過程被稱為DNA的“熔解”。隨著溫度的升高，DNA的熒光強度會發生變化，通過監測這種變化，可以繪制出DNA的熔解曲線。探針法熔解曲線分析利用特異性探針結合到目標DNA序列上，通過對探針與目標DNA結合狀態的溫度依賴性檢測，來識別和定量特定的DNA或RNA序列。

二、關鍵技術

01 熒光探針

TaqMan探針：基于水解作用釋放熒光，用于實時定量PCR。

分子信標：莖環結構結合目標后熒光恢復，特異性高。

蝎形探針：整合引物與探針功能，可多靶點檢測。

雙雜交探針：依賴熒光共振能量轉移（FRET）實現信號檢測。

構成：探針通常由三部分組成
（1）熒光基團：如FAM、VIC等，用于發射熒光信號。
（2）淬滅基團：如TAMRA、BHQ等，用于淬滅熒光信號。
（3）特異性序列：與目標DNA序列互補結合。

作用機制：探針與目標序列結合時，熒光基團與淬滅基團分離，釋放熒光信號；當探針與目標序列解離時，熒光信號減弱或消失。

02 PCR擴增

引物設計：設計特異性引物，確保目標序列的高效擴增。

探針加入：在PCR反應體系中加入熒光探針，實時監測熒光信號的變化。

03 熔解曲線分析

溫度梯度：PCR完成后，逐步升溫（通常從60°C升至95°C），使DNA雙鏈和探針-目標復合物解離。

熒光監測：實時監測熒光信號的變化，記錄熒光強度隨溫度的變化曲線。

Tm值：探針與目標序列的解離溫度（Tm）取決于序列的匹配程度，完全匹配與錯配的Tm值不同。

三、技術流程

探針設計：設計特異性探針，確保其與目標序列完全匹配。

PCR擴增：將探針、引物、模板DNA和熒光染料加入反應體系，進行PCR擴增。

熔解曲線分析：PCR完成后，逐步升溫，實時監測熒光信號的變化。

數據分析：根據熔解曲線的峰值（Tm值）判斷目標序列的特性。

四、技術特點

特異性高：探針法熔解曲線分析利用特異性探針結合到目標DNA序列上，通過監測探針與目標DNA結合狀態的溫度依賴性變化，能夠精確識別和定量特定的DNA或RNA序列。當探針與目標序列完全匹配時，熔解溫度（Tm值）較高；如果存在單核苷酸多態性（SNPs）或其他變異，Tm值會下降，從而可以精確識別序列差異。

靈敏度高：探針法熔解曲線技術能夠檢測到非常低的DNA濃度變化，適用于微量樣本的檢測。通過監測熒光信號的變化，可以實現對目標序列的靈敏檢測。

操作簡便：相比其他分子生物學技術，探針法熔解曲線技術的操作相對簡便。實驗者只需在PCR反應結束后進行DNA雙鏈產物升溫解鏈反應，監測熒光信號的變化即可繪制出熔解曲線。

應用廣泛：該技術廣泛應用于基因分型、SNP檢測、病原體鑒定等領域。通過比較不同樣本的熔解曲線，可以精確地識別出序列差異，為遺傳學研究和臨床診斷提供重要依據。

峰型倒置現象：在探針法熔解曲線中，有時會出現峰型倒置現象，即在某個溫度點后熒光信號反而增強。這種現象可能是由于探針解離動力學、非特異性產物、引物二聚體、探針設計問題或熒光染料特性等因素引起的。雖然這種現象可能指示實驗中的非特異性事件，但也可以通過合理設計和優化實驗條件來避免或解釋這種現象。

五、應用領域

基因分型：用于檢測SNP、插入/缺失等遺傳變異。

突變檢測：識別點突變、基因重排等。

病原體鑒定：快速檢測病毒、細菌等病原體的特異性序列。

腫瘤標志物檢測：用于腫瘤相關基因突變的篩查。

藥物基因組學：研究藥物代謝相關基因的多態性。