使用G418篩選HEK-293T細(xì)胞的詳細(xì)步驟

使用G418篩選HEK-293T細(xì)胞的詳細(xì)步驟

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇HEK-293T細(xì)胞，用合適的培養(yǎng)基（如DMEM高糖培養(yǎng)基，含 10%胎牛血清等）在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%-90% 時(shí)進(jìn)行傳代或轉(zhuǎn)染操作。
2. 確定G418篩選濃度：如客戶所做，在96孔板中接種細(xì)胞，設(shè)置 0 - 1100 μg/mL的G418濃度梯度，用CCK8 檢測(cè)培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞活性，繪制細(xì)胞活力圖，確定HEK-293T細(xì)胞的G418 最小致死量。
3. 轉(zhuǎn)染：將目的基因連接到pCDNA3.1載體上，使用合適的轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine 3000 ），按照試劑說明書將重組載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換液。
4. 加藥篩選：轉(zhuǎn)染后1 - 2天，根據(jù)確定的最小致死量，加入適量G418進(jìn)行篩選。可以先采用較低濃度篩選一輪，比如最小致死量的 1/2 - 2/3濃度，維持篩選2 - 3周，期間每2 - 3天換液并補(bǔ)充G418 。然后再用較高濃度（接近或等于最小致死量）進(jìn)行第二輪篩選1 - 2周。
5. 單克隆挑選：待細(xì)胞形成單克隆后，用有限稀釋法或細(xì)胞克隆環(huán)將單克隆細(xì)胞挑選到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。

HEK-293T細(xì)胞篩選注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞狀態(tài)：確保用于轉(zhuǎn)染和篩選的HEK-293T細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，細(xì)胞活力應(yīng)在90% 以上，且無支原體等污染。
2. 轉(zhuǎn)染效率：優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，包括轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等，以提高轉(zhuǎn)染效率。可設(shè)置不同轉(zhuǎn)染條件的對(duì)照組，確定最佳轉(zhuǎn)染方案。
3. G418質(zhì)量：G418的質(zhì)量對(duì)篩選結(jié)果影響較大，應(yīng)選擇質(zhì)量可靠的產(chǎn)品，使用前檢查其效價(jià)和純度，溶解后過濾除菌，-20 ℃保存。
4. 篩選濃度：篩選濃度需根據(jù)細(xì)胞活力圖結(jié)果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)確定，濃度過低可能導(dǎo)致假陽性細(xì)胞過多，過高則可能殺死陽性細(xì)胞。
5. 換液頻率：篩選期間換液頻率不宜過高或過低，過高可能導(dǎo)致細(xì)胞生長受影響，過低可能使代謝廢物積累影響細(xì)胞狀態(tài)和篩選效果。
6. 無菌操作：整個(gè)篩選過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止雜菌污染。


文獻(xiàn)資料:
• 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第四版）》
• 《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程》
• Kaufman R J. Large-scale mammalian cell culture[J]. Current opinion in biotechnology, 1990, 1(2): 175-180.