實時熒光定量PCR原理和應用

 實時熒光定量PCR（qPCR）是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。該技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它的出現解決了傳統PCR不能對初始模板定量分析的問題。熒光定量PCR具有準確性高、靈敏度高、特異性強等優點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。

熒光定量PCR原理

在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化檢測產物量的變化，末了得到一條熒光擴增曲線圖，擴增曲線橫坐標表示循環數，縱坐標表示熒光強度。

熒光定量PCR常用術語
 

1. 基線：實時熒光定量PCR反應的基線是指在PCR的最初幾個循環中（一般為3-15個循環）的信號水平。此階段的熒光信號變化量極小。
2. 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，一般熒光閾值默認是PCR 3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍。
3. Ct值：Ct值指的是PCR擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的循環數。
4. 標準曲線：標準曲線是標準物質的物理/化學屬性跟儀器響應之間的函數關系。對已知拷貝數的標準樣品做系列稀釋，對不同稀釋度的標準樣品進行熒光定量PCR并記錄Ct值，根據Ct值及拷貝數的對數繪制得到標準曲線，標準曲線的縱坐標代表起始拷貝數的對數，橫坐標代Ct值。
5. 實現對初始模板的定量
6. 利用實時熒光定量 PCR對樣品的初始模板量進行定量分析，需要利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，再通過熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值，最后從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
7. 標準曲線繪制
8. 標準品的制備：設計特定引物，利用PCR對目的基因片段進行擴增，隨后將目的基因片段克隆至載體中，測序驗證是否為陽性重組質粒，最后收集陽性克隆質粒作為標準品。
9. 繪制標準曲線：測定質粒的濃度，依據公式計算出質粒的拷貝數。對質粒進行系列稀釋，分別作為模板進行熒光定量PCR并記錄Ct值。最后依據起始拷貝數的對數及Ct值繪制標準曲線，得到標準方程。當需要對起始模板進行定量時，只需要得到擴增曲線，讀得Ct值，帶入標準方程即可對起始模板定量。

熒光標記方法

熒光定量PCR熒光標記方法可分為熒光染料法和熒光探針法兩類。
 

• 熒光染料：染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內部的特性，來指示擴增產物的增加。
• 熒光探針：探針為一段寡核苷酸，可與DNA序列特異性結合，一個模板結合一個探針。探針5’端具有報告基團（R），可發光；3’端有熒光淬滅基團（Q），能吸收光。探針完整時R基團所發射的熒光能量被Q基團吸收，PCR儀檢測不到熒光信號。隨著擴增的進行，探針會被聚合酶水解，報告基團發出的光沒有被淬滅基團吸收，從而被儀器檢測到。

熒光探針與染料法對比

探針法：特異性高、重復性好，但只適合一個特定的目標，探針價格較高。
染料法：對DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA，使用方便，成本低，但容易與非特異性雙鏈DNA結合，產生假陽性。

熒光定量PCR應用

  實時熒光PCR技術已廣泛應用于醫學及生命科學研究的各個領域中。在科研方面可定量分析各種基因的表達分析，基因突變和多態性分析，單核苷酸多態SNP測定及易位基因的檢測；在醫學方面可用于免疫組化分析、早期篩查、病原體檢測、耐藥性分析、腫瘤微小殘留病變研究等。