PCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程詳細(xì)介紹

一、概述
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR）是一種在體外合成雙鏈DNA的技術(shù)。其原理模仿了天然DNA的復(fù)制過(guò)程，通過(guò)特異引物和高特異性酶，確保反應(yīng)的特異性。典型的PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：變性、退火和延伸，通過(guò)多次循環(huán)，最終獲得目標(biāo)DNA片段。

二、試劑準(zhǔn)備
以下為進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑及其終濃度：

試劑 終濃度	PCR buffer 1x
dNTPs <0.4mM	Forward primer <0.4uM
Reverse primer <0.4uM	Template DNA <100ng
熱啟動(dòng)酶 5U	ddH2O Up to 50 ul

三、操作步驟
1. 配置反應(yīng)體系
將以下成分按順序加入0.5ml的離心管中：
l 加入PCR buffer。
l 加入dNTPs。
l 加入Forward primer。
l 加入Reverse primer。
l 加入Template DNA。
l 加入熱啟動(dòng)酶。
l 用ddH2O補(bǔ)至總體積50 ul。
注意：使用熱啟動(dòng)酶時(shí)，可在常溫下操作；非熱啟動(dòng)型酶需在低溫下配置反應(yīng)體系。 
2. 設(shè)置反應(yīng)條件
根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)時(shí)間和溫度，完成擴(kuò)增后進(jìn)行電泳鑒定。
3. 瓊脂糖核酸電泳
①　準(zhǔn)備電泳器具，用蒸餾水洗凈并架好梳子。
② 根據(jù)所需分離的DNA片段大小，制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠。
③ 將瓊脂糖和電泳緩沖液（TAE或TBE）加入錐形瓶中，加熱融化后冷卻至40℃左右，混勻并倒入電泳槽。
④　室溫下凝固凝膠，拔出梳子，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。
⑤　在電泳槽中加入電泳緩沖液，確保覆蓋凝膠表面。
⑥ 混合5ul樣品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料，緩緩注入點(diǎn)樣孔，避免串孔。
⑦ 接通電源（紅正黑負(fù)），設(shè)置電壓40-60V，電泳時(shí)間30-40min，根據(jù)溴酚藍(lán)的位置判斷是否終止電泳。
⑧ 電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，進(jìn)行凝膠成像觀察，并對(duì)比marker確定片段大小。
不同瓊脂糖濃度對(duì)應(yīng)的DNA片段大小如下表：

瓊脂糖濃度/% DNA 大小 /kb	0.3 5-60
0.5 1-30	0.7 0.8-12
1.0 0.5-10	1.2 0.4-7
1.5 0.2-3	2.0 0.05-2

四、注意事項(xiàng)
引物設(shè)計(jì)
Ø 引物應(yīng)設(shè)計(jì)在cDNA的保守區(qū)域。
Ø 引物長(zhǎng)度應(yīng)在15-28bp之間。
Ø GC含量應(yīng)在40%-60%之間。
Ø 避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，完成后進(jìn)行BLAST驗(yàn)證。

模板DNA
Ø 模板可以是單鏈或雙鏈DNA。
Ø 不同來(lái)源的模板起始濃度有一定要求。
Ø 模板提取后應(yīng)注意保存，避免降解。
其他
Ø 選擇合適的Taq DNA聚合酶。
Ø 確保四種dNTP濃度相同。
Ø 操作過(guò)程中戴手套，保持環(huán)境干凈，防止污染。
Ø PCR用水需經(jīng)過(guò)高壓滅菌或0.2um濾膜過(guò)濾。
五、常用試劑配方
電泳緩沖液
50xTAE（pH8.5）
Tris 242g
EDTA（Na）37.2g
Ø 加入800ml去離子水，攪拌溶解
Ø 加入57.1ml乙酸，調(diào)pH至8.5后定容至1L
10xTBE（pH8.3）
Tris 108g
EDTA 7.44g
硼酸55g
Ø 加入800ml去離子水，攪拌溶解，調(diào)pH至8.3后定容至1L
上樣緩沖液（6xLoding buffer）
0.25%二甲苯青
0.25%溴酚藍(lán)