DAP-seq技術助力揭示MdWRKY75調控蘋果耐熱性的分子機制

2024年6月12日，西北農林科技大學作物抗逆與高效生產全國重點實驗室/園藝學院蘋果抗逆與品質改良創新團隊馬鋒旺教授/李超課題組在植物學知名期刊The Plant Cell（影響因子10）在線發表了題為“The MdHSC70-MdWRKY75 module mediates basal apple thermotolerance by regulating the expression of heat shock factor genes”的研究論文，揭示了MdHSC70-MdWRKY75模塊調控MdHsfs參與蘋果耐熱性的新機制。

蘋果（Malus × domestica）是世界上最具經濟價值的水果之一，對人類健康和促進我國北方農民增收、鄉村振興及生態環境改善等方面發揮重要作用。我國是世界上最大的蘋果生產和消費國，但大多數蘋果產區夏季高溫，導致蘋果生長發育不良，嚴重制約了蘋果產業的優質高效發展。因此，挖掘和鑒定蘋果耐熱基因，探究蘋果熱脅迫的調控機制，能夠為蘋果耐熱分子設計育種提供理論依據和基因資源，對全球氣候變暖背景下蘋果產業可持續發展具有重要意義。

在該研究中，作者首先發現MdWRKY75的表達受熱脅迫誘導上調。隨后，作者通過遺傳轉化技術獲得了MdWRKY75過表達和干擾蘋果植株，對轉基因植株進行高溫處理后發現，MdWRKY75正調節蘋果耐熱性（圖1）。

圖1 MdWRKY75正調控蘋果耐熱性

通過RNA-seq、DAP-seq（圖2）以及RT-qPCR試驗篩選到MdWRKY75在熱脅迫下的5個潛在靶基因。EMSA、酵母單雜交、GUS和雙熒光素酶試驗證明MdWRKY75正調控熱激轉錄因子MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表達。通過瞬時轉化技術證明這三個熱激轉錄因子均正調節蘋果耐熱性。在MdWRKY75-Ri3的背景下對這三個MdHsfs進行過表達均能挽救其熱敏感表型，說明MdWRKY75的耐熱性是通過激活這三個熱激轉錄因子的表達實現的。

圖2 DAP-seq鑒定了MdWRKY75在全基因組上的結合情況及識別位點

隨后，作者通過酵母雙雜交篩庫篩選到與MdWRKY75互作的熱激蛋白MdHSC70。分別通過瞬時過表達和VIGS技術證明MdHSC70是蘋果耐熱性的負調節因子。GUS、雙熒光素酶和EMSA試驗證明MdHSC70通過與MdWRKY75互作并抑制其對MdHsfs的激活作用。在MdWRKY75-OE3的背景下分別對MdHSC70進行瞬時過表達和沉默后發現，過表達MdHSC70顯著降低了MdWRKY75-OE3的耐熱性，而沉默MdHSC70的植株耐熱性與MdWRKY75-OE3無顯著差異，表明MdHSC70的熱敏表型是由MdWRKY75介導的。

綜上所述，該研究明確了MdWRKY75通過激活MdHsfs的表達正調控蘋果耐熱性的生物學功能，闡明了MdHSC70與MdWRKY75互作并抑制其對MdHsfs調控的分子機制（圖3）。研究結果豐富了蘋果應對高溫環境的分子調控網絡，也為蘋果的分子定向育種提供基因資源和理論基礎。

圖3 MdHSC70-MdWRKY75-MdHsfs模塊調節蘋果耐熱性的分子機制