Ribo-seq與RNA-seq聯合分析揭示uAUG-ds翻譯調控機制

技術簡介
RNA-seq主要從轉錄組水平分析基因的表達調控機制，檢測用于核糖體翻譯的RNA序列及二級結構。Ribo-seq主要用于檢測核糖體翻譯的起始位置、翻譯富集區和翻譯終止位置。RNA-seq與Ribo-seq聯合分析可以準確檢測mRNA上游5’UTR區的uORFs翻譯調控結構，揭示生物模式觸發免疫下的翻譯調控機制。
 
文獻速遞
2023年發表在Nature上的“Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection”文章，發現在uORFs區的uAUGs下游存在雙鏈結構，可動態調節mORFs區蛋白的表達。文章主要提出了對防御性蛋白表達基因（順勢作用）的兩種調節狀態：

• 正常情況下，uAUG-ds結構誘導核糖體選擇性翻譯uORF，抑制下游mORFs翻譯，抑制防御性蛋白的表達。
• 在受到免疫攻擊后，誘導RNA解旋酶將uAUG-ds結構打開，使核糖體可以繞過uAUGs，翻譯下游防御蛋白。

 
研究首先對正常處理和elf18誘導免疫處理的擬南芥樣本進行RNA-seq和Ribo-seq測序。綜合RNA-seq數據和Ribo-seq數據，對檢測到的25,554個可表達的轉錄物進行分析，篩選得到13,051個mAUGs上游5’UTR含有uAUGs的可表達轉錄物（含有uAUGs）。對比正常處理和elf18處理樣本的翻譯效率（TE），將這13,051個轉錄物分為TE-up、TE-nc和TE-down三組，通過GO分析發現了TE-up組基因與相應環境脅迫等生物過程有關，而TE-down組基因主要是與生長相關代謝過程有關（Extended Data Fig.2）。 Extended Data Fig. 2 Global analysis of translational dynamics and dual-luciferase reporter study of uAUG-containing transcripts.
 
為了鑒定uAUGs在翻譯調控中的作用，研究又從這13,051個轉錄物中篩選出翻譯型uAUGs，發現翻譯型uAUGs在TE-up組中顯著富集，表明了uAUGs在調節免疫相關翻譯中具有普遍作用（Fig. 1b）。研究還對比了正常處理和elf18誘導免疫處理下，TE-up組轉錄物中的翻譯型uAUGs特征，發現在正常處理下翻譯型uAUGs的翻譯起始率較高（核糖體占有率），而elf18處理后這種類型的uAUGs翻譯起始率顯著降低（Fig. 1e）。由于uAUGs起始的翻譯通常會抑制下游mORFs翻譯，所以在elf18處理下uAUGs起始的翻譯的減少也解除了對下游mORFs翻譯的抑制作用。 Fig. 1 Translational dynamics of uORF-containing transcripts.
 
為了確定uAUGs影響翻譯起始的機制，研究首先評估了所有表達轉錄本中的Kozak序列（一級結構），發現mAUGs比uAUGs仍具有更好的Kozak序列，而且TE-up、TE-nc和TE-down轉錄物中翻譯型uAUGs的Kozak序列也是相似的（Fig. 2a），表明了在TE-up轉錄物中elf18介導的從uAUGs到mAUG的翻譯起始的轉換還與其他序列結構有關。研究下一步使用SHAPE-MaP法來探究RNA二級結構對翻譯起始識別的影響。研究定量檢測了細胞內的RNA結構，發現具有較高SHAPE反應的區域更可能是單鏈結構。研究進一步使用正常處理和elf18處理樣本中mRNAs的數據進行結構建模，發現盡管5’UTR取和CDSs區在SHAPE反應上是相似的，但在所有表達轉錄物中mAUGs下游雙鏈結構或蛋白質結合水平較高（低SHAPE反應）（Fig. 2b）。研究同時對上下游核苷酸SHAPE反應分析發現，mAUGs和翻譯型uAUGs下游比上游表現出明顯的低SHAPE反應，而非翻譯型uAUGs沒有這種現象（Fig. 2c）。研究又對比了正常處理下和elf18處理下的不同轉錄效率（TE-up、TE-nc和TE-down）轉錄物種的uAUGs的SHAPE反應情況，發現正常處理下TE-up轉錄物中的翻譯型uAUGs下游具有較低的SHAPE反應，表明了uAUGs下游存在二級結構。研究通過缺乏蛋白質實驗，排除蛋白質結合導致低SHAPE反應，進一步確認了雙鏈RNA二級結構（mAUG-ds和uAUG-ds）影響翻譯起始調控的可能性。
為了直接觀察結構模式與AUGs的翻譯起始的關系，研究開發了基于一級序列和結構數據的TISnet模型，來預測翻譯的起始位點。經過mAUGs和internal AUGs數據訓練的模型，可以預測到翻譯型uAUGs和非翻譯型uAUGs之間存在顯著差異（Extended Data Fig. 5d）。模型預測出的起始型uAUGs下游序列比非起始型具有更高的負折疊自由能（易形成二級結構）（Fig. 2e）和更高的核糖體占有率（Fig. 2i），表明TISnet模型也可以準確預測翻譯型uAUGs。以上研究表明了在正常情況下，AUGs下游RNA二級結構可以促進該位置的翻譯起始，與上游RNA二級結構抑制翻譯起始相反。 Fig. 2 Global SHAPE-MaP and deep learning analyses reveal hairpin structures downstream of mAUGs and uAUGs that have a role in dictating translation initiation.
 
通過分析Ribo-seq數據，研究發現了TE-up轉錄物中elf18處理可以啟動uORFs翻譯起始到mORFs翻譯起始的轉變。首先是觀察到在elf18處理下uAUGs下游SHAPE反應增加（二級結構解鏈），并且TE-up轉錄物uAUG-ds結構變化受免疫誘導影響程度更大（Fig. 3a）。研究提出了假設，免疫誘導降低了uAUG-ds結構復雜性，啟動下游mAUGs的翻譯。研究進一步通過構建uAUG2-ds突變表達系統，驗證了uAUGs下游雙鏈結構有助于通過促進uAUGs的翻譯起始來抑制uORF介導的下游mORF翻譯。研究者還在植物和人細胞系中證實了這些結果，并通過對腫瘤抑制基因的突變體分析，發現了抑制BRCA1的mRNA翻譯的uAUGs-ds結構（Fig.3g right）。 Fig. 3 RNA secondary structures downstream of uAUGs dynamically regulate translation.
 
接下來研究者試圖去了解elf18誘導是如何促進uAUGs-ds解旋的。研究者主要選擇了DEAD-box RNA解旋酶進行研究，發現免疫誘導的解旋酶表達水平增加可能促進uAUGs-ds的解旋，從而降低uAUG介導的mORF翻譯的抑制。研究通過構建解旋酶表達系統證實了elf18誘導的RNA解旋酶參與了TE-up轉錄物中uAUG-ds的解旋，并促進了下游防御蛋白的表達。
 
小結
研究使用RNA-seq、Ribo-seq和深度學習算法聯合分析了轉錄組范圍的翻譯和結構特征，并且將結果擴展到其他生物體中，揭示了uAUG-ds作為調節基因表達的分子開關，動態調節防御性蛋白基因及腫瘤抑制基因的表達。