快速開始DSP空間組學(xué)研究的6個(gè)步驟詳解

想要在時(shí)下最熱的空間組學(xué)領(lǐng)域中取得豐碩的研究成果，自然少不了前沿技術(shù)平臺(tái)的運(yùn)用。而GeoMx® DSP空間組學(xué)技術(shù)平臺(tái)就是這樣一個(gè)表現(xiàn)突出的空間組學(xué)研究利器，參與的研究可謂“高分頻出，成果矚目”。

面對(duì)GeoMx® DSP不知從何入手？不妨通過6個(gè)步驟快速上手，開展屬于你自己的空間組學(xué)研究。

如果你還不了解什么是DSP，不妨先閱讀DSP空間多組學(xué)技術(shù)Q&A大揭秘再閱讀本篇文章。

1、你在研究組織的哪個(gè)區(qū)域，為什么？

在確定要研究的疾病區(qū)域和組織類型之后，就可以思考：要研究組織的哪個(gè)區(qū)域以及為什么研究這個(gè)區(qū)域？我們可以把這個(gè)過程稱之為“定義空間問題”。

可以用4個(gè)問題來引導(dǎo)你定義空間問題：

1. 是否有一個(gè)特定的假設(shè)，或者只是在尋找組織的異質(zhì)性并發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)現(xiàn)象?

2. 是要在每個(gè)樣本上對(duì)相同的組織區(qū)域進(jìn)行采樣，并將不同的樣本進(jìn)行比較（如正常組織和患病組織），還是要在一個(gè)樣本中對(duì)不同區(qū)域的組織或細(xì)胞群體進(jìn)行比較?

3. 有沒有什么細(xì)胞類型是你特別感興趣的，如果有，你想描述這些細(xì)胞在組織不同區(qū)域的分布特征及基因表達(dá)特征嗎?

4. 組織內(nèi)是否有一個(gè)關(guān)鍵特征，如腫瘤浸潤(rùn)邊緣、淀粉樣斑塊或神經(jīng)原纖維纏結(jié)，你想用它作為測(cè)量表達(dá)的組織標(biāo)簽么？

例：CD45+免疫細(xì)胞在乳腺癌中腫瘤和腫瘤微環(huán)境的不同區(qū)室中的基因或蛋白表達(dá)，特別是在腫瘤核心、沿腫瘤邊緣和鄰近基質(zhì)中，是如何不同的？

2、轉(zhuǎn)錄組還是蛋白質(zhì)組？

定義空間問題之后，需要決定分析RNA還是蛋白質(zhì)，亦或是都分析。DSP可以單獨(dú)分析RNA或蛋白質(zhì)，也可以同時(shí)分析單個(gè)樣品中的RNA和蛋白質(zhì)。

例：分析人類結(jié)直腸癌FFPE組織切片中的RNA。

3、選擇適合的形態(tài)學(xué)marker

DSP工作流程的第一步是用熒光標(biāo)記的抗體或探針對(duì)組織進(jìn)行染色，以便對(duì)組織進(jìn)行成像并更好地了解組織形態(tài)。由于組織成像后，需要根據(jù)熒光染色選擇要分析的感興趣區(qū)域（ROI），因此選擇適合的形態(tài)學(xué)marker十分重要。

一個(gè)典型的DSP實(shí)驗(yàn)最多使用四種形態(tài)學(xué)marker：一種通常是DNA核染（典型的是SYTO 13)，另外三種可以通過實(shí)驗(yàn)定義。幾個(gè)商業(yè)上可用的形態(tài)學(xué)marker試劑盒適用于人類或小鼠組織的腫瘤學(xué)或神經(jīng)科學(xué)研究。

例：使用含有CD45、PanCK和SYTO13的實(shí)體瘤形態(tài)學(xué)marker試劑盒進(jìn)行形態(tài)學(xué)標(biāo)記染色。
 

PanCK可作為區(qū)分結(jié)腸腺瘤的標(biāo)志物。結(jié)腸腺瘤細(xì)胞和周圍微環(huán)境分別通過PanCK+和PanCK-片段富集。

4、確定ROI圈選策略

選定適合的形態(tài)學(xué)marker后，需要考慮你想要選擇組織或細(xì)胞類型的哪個(gè)區(qū)域進(jìn)行表達(dá)譜分析。DSP支持5種圈選策略：幾何圈選、細(xì)胞亞型圈選、等高線圈選、網(wǎng)格分析圈選以及稀有細(xì)胞圈選。

建議每種類型至少有6個(gè)ROI，除了便于進(jìn)行有意義的統(tǒng)計(jì)分析外，還可以防止在隨后的處理步驟中，即使丟失了來自一對(duì)ROI的分析探針，實(shí)驗(yàn)仍能輸出有意義的結(jié)果。

為了最大限度地提高靈敏度并實(shí)現(xiàn)高級(jí)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用，如不同免疫細(xì)胞類型的空間反卷積，需要確保每個(gè)ROI至少有100個(gè)細(xì)胞用于分析RNA，至少有50個(gè)細(xì)胞用于分析蛋白質(zhì)。

例：分別在腫瘤內(nèi)、浸潤(rùn)邊緣和間質(zhì)處采用幾何圈選CD45+作為ROI。

5、提前想好如何處理產(chǎn)出的數(shù)據(jù)

想要研究順利開展，必須事先對(duì)“將進(jìn)行哪些具體的比較來評(píng)估差異表達(dá)”有一定的設(shè)想。換句話說，就是哪組ROI將相互比較。重要的是要考慮比較具有近似相同面積的ROI組，具有相似的組織類型和所表示的細(xì)胞數(shù)量。通過了解將進(jìn)行哪些具體的數(shù)據(jù)比較，可以在為任何給定研究準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)盡量減少引入技術(shù)誤差。

6、開始進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)

確定ROI位置后，可以開始設(shè)計(jì)一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)來摸索實(shí)驗(yàn)條件，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利開展打下基礎(chǔ)。

如果你對(duì)上述1-5個(gè)步驟所涉及到的問題，都已經(jīng)十分明確，想要進(jìn)一步評(píng)估自己的研究是否適合利用DSP開展，亦或是還有其他疑慮，也歡迎隨時(shí)聯(lián)系我們進(jìn)行咨詢。在空間組學(xué)方面，SBC搭建了10x Visium Cytassist、GeoMx® DSP、CosMx™ SMI以及LCM+timsTOF Pro平臺(tái)，打造空間生物學(xué)全鏈條創(chuàng)新多組學(xué)平臺(tái)及解決方案，助力科學(xué)發(fā)現(xiàn)。