蛋白質印跡或免疫印跡的常見問題及其解決方案
蛋白質印跡或免疫印跡 (Western blot，簡稱 WB) 是一種常見的實驗室方法，用于檢測蛋白質并評估其表達水平。根據其分子量和與特定抗體的免疫反應性來鑒定感興趣的蛋白質。蛋白質印跡由一系列相互關聯的步驟組成 (圖 1)[1]。
圖 1. 蛋白質印跡相互關聯的步驟[1]。
(1) 將樣品 (通常是蛋白質混合物) 加載到凝膠上。Marker 標記包含各種已知分子量的預標記蛋白質，與蛋白質樣品一起加載到凝膠上作為尺寸參考。(2) 凝膠電泳用于根據蛋白質的分子量來分離蛋白質。(3) 將蛋白質轉移或“印跡”到膜上。(4) 封閉膜以減少非特異性結合，然后依次用特異性結合目標蛋白的一抗和二抗進行探測。后者結合一抗并攜帶允許隨后檢測的酶或熒光團。(5) 分別通過化學發光反應或熒光檢測信號。(6) 準備蛋白質印跡圖像以供發表。
由于該實驗時間長、細節多，從樣品制備到顯影，每個步驟中都可能存在問題，最后得到的條帶往往千奇百怪、不盡人意……在這篇推文中，我們將為您介紹一些常見的 WB 實驗問題以及相應的解決方案[2]。小 M 助您避免實驗中的各種困擾，快來看看吧！
▐ 1. 微笑條帶：
可能性原因：遷移過快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質超載或孔內運行緩沖液不足。
建議：應降低遷移速度、預冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔，確保內室緩沖液不會泄露到外室[4][6]。
▐ 2. 皺眉條帶：
建議：可通過調整裝置來避免該問題。
▐ 3. 條帶拖尾：
建議：樣品充分溶解混勻后上樣；盡量使用新鮮樣本；使用新鮮配制的電泳緩沖液。
▐ 4. 啞鈴狀不均勻條帶：
建議：重新配置膠，確保膠質量無問題來避免該現象出現；在樣品使用前離心。
▐ 5. 條帶粘連：
建議：可通過減少上樣量和提高配膠質量來避免。
▐ 6. 條帶空泡：
建議：確保在組裝“三明治”時，移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。
▐ 7. 背景有不均勻的黑色斑點：
建議：封閉液一定要充分溶解，封閉結束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗；抗體孵育時保持搖動。
▐ 8. 條帶空斑：
建議：可減少蛋白上樣量；降低一抗和二抗濃度；或者稀釋顯影液。
通過本篇推文介紹，相信普通的難題已經難不倒你們了! 如果以上內容沒有解決您的問題，歡迎大家在下方留言，小 M 歡迎大家積極交流實驗中遇到的各種疑難問題~
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Beta Actin Antibody HRP Conjugated 常用的內參抗體之一，可檢測 Beta Actin 總蛋白的內源水平。 |
| 可檢測 alpha-tubulin 總蛋白的內源水平，并不會與重組 β-tubulin 蛋白發生交叉反應。 |
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該抗體可檢測 c-Myc 總蛋白的內源水平。 |
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HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG H&L 鼠二抗，山羊來源的抗小鼠 IgG 抗體，用于小鼠背景下 WB、ELISA、IHC 實驗。 |
| HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG H&L
兔二抗，山羊來源的抗兔 IgG 抗體，用于兔子背景下 WB、IHC-P、ELISA 實驗。 |
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Ultra High Sensitivity ECL Kit 飛克級別抗原檢測，一抗稀釋比可達釋1:1000 至1:50000 倍。 Protease Inhibitor Cocktail, mini-Tablet (EDTA-Free) 在樣品制備、保存中可增加蛋白穩定性。 |
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參考文獻：
[1] Kroon C, et.al. Blind spots on western blots: Assessment of common problems in western blot figures and methods reporting with recommendations to improve them. PLoS Biol. 2022 Sep 12;20(9):e3001783.
[2] Cui Y. Optimization of blocking conditions for fluorescent Western blot. Anal Biochem. 2020 Mar 15;593:113598.
[3] Begum H, et al. Western blotting: a powerful staple in scientific and biomedical research. Biotechniques. 2022 Jun;73(1):58-69.
[4] Mary Johnson. Materials and Methods ，Western Blot - Protocol, Troubleshooting, and Survey Results on Instruments and Reagents.
[5] Gilda JE, et al. Western Blotting Inaccuracies with Unverified Antibodies: Need for a Western Blotting Minimal Reporting Standard (WBMRS). PLoS One. 2015 Aug 19;10(8):e0135392.
[6] Sule R, et al. Western blotting (immunoblotting): history, theory, uses, protocol and problems. Biotechniques. 2023 Sep;75(3):99-114.
