DNA甲基化技術(shù)及其優(yōu)劣勢比較

全基因組甲基化研究策略
一、甲基化芯片

以Illumina的450K芯片為例，該芯片采用兩種分析：Infinium I和Infinium Ⅱ，前者有兩種bead（微珠），分別是甲基化M和非甲基化U，后者則是一種bead（不區(qū)分甲基化和非甲基化）。

如圖A：Infinium I，在未甲基化的GpC locus，U型bead尾部為A，與未甲基化CpG位點(diǎn)相匹配，能夠成功進(jìn)行單核苷酸延伸并被檢測到（U型磁珠發(fā)光），而M型bead尾部為G，與未甲基化位點(diǎn)不能匹配，沒有信號產(chǎn)生；在甲基化的GpC locus，M型bead能與甲基化CpG位點(diǎn)相匹配，單核苷酸延伸并產(chǎn)生信號（M型磁珠發(fā)光），而U型bead則不匹配，不產(chǎn)生信號

如圖B：Infinium Ⅱ探針則不區(qū)分M和U，探針尾部為C，配對后只加入單個堿基（ddNTP-BioT， ddNTP-DNP），然后根據(jù)熒光顏色判斷加入堿基的類型，進(jìn)而確定該位點(diǎn)是否被甲基化

探針長度為50bp，基于假設(shè)在50bp內(nèi)的CpG位點(diǎn)具有相同的甲基化狀態(tài)，具有區(qū)域相關(guān)性

通過計(jì)算甲基化和非甲基化位點(diǎn)的熒光信號比例，可確定某位點(diǎn)的甲基化水平（Beta值=M/(M+UM)

二、WGBS

三、簡化亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（RRBS）

RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing) ，即簡并代表性亞硫酸氫鹽測序技術(shù)。是一種用于基因組單核苷酸級別的甲基化水平分析的高效的高通量測序技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了限制性內(nèi)切酶和亞硫酸氫鹽測序，從而得到高CpG區(qū)域的富集信息。相比較全基因組甲基化測序技術(shù)，RRBS僅需要對基因組約1%的區(qū)域進(jìn)行測序，因此費(fèi)用大大降低。

技術(shù)流程

1. 酶切；2.末端補(bǔ)齊；3.測序文庫制備；4.純化；5.亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；6.PCR擴(kuò)增；7.PCR純化；8.測序；9.測序數(shù)據(jù)比對與分析

甲基化芯片

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測，信息量大；在人中有效檢測和生物學(xué)時間相關(guān)區(qū)域的甲基化；

缺點(diǎn)：芯片雜交要求的設(shè)備昂貴；芯片限于人的樣本；只能覆蓋有限的CpG位點(diǎn)。

WGBS

優(yōu)點(diǎn)：通量高 ，全基因組范圍；單堿基分辨率；

缺點(diǎn)：成本高，不適于大樣本研究分析；不適于特異位點(diǎn)、基因或區(qū)段研究。

RRBS

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測；分辨率達(dá)到CpG水平；不依賴限制性位點(diǎn)；樣本被精簡過，導(dǎo)致測序成本低；

缺點(diǎn)：雖然降低了成本，但價(jià)格仍然較高；對甲基化CpG覆蓋程度有限；目的不夠明確；基因組覆蓋不全容易遺漏一些關(guān)鍵的區(qū)間。

特異位點(diǎn)甲基化研究策略
一、甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶

優(yōu)點(diǎn)：相對簡單,成本低廉，甲基化位點(diǎn)明確,實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋；

缺點(diǎn)：

1.由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；

2.只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時,該檢測方法的結(jié)果才有意義；

3.相對而言，Southern方法較復(fù)雜，且需要樣本的量大；

4.存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題;

5.不適用于混合樣本；

6.雜交需要放射性標(biāo)記；

7.覆蓋有限的CpG位點(diǎn)。

二、Bisulfite sequencing PCR (BSP)

基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計(jì)BSP引物擴(kuò)增目的片段，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆并選取8-10個轉(zhuǎn)化子序列，即可確定所研究的CpG區(qū)域的甲基化頻率。

優(yōu)點(diǎn)：可定性和定量檢測CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)；片段有效長度較長；

缺點(diǎn)：通量低；成本高（測序成本和未轉(zhuǎn)化對照）；實(shí)驗(yàn)周期較長；直接測序信號質(zhì)量差，克隆測序操作繁瑣，不宜大批量操作。

三、Methylation specific PCR (MSP)

首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，然后針對甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，操作方便，經(jīng)濟(jì)適用，節(jié)約時間；

缺點(diǎn)：只能定性，不可定量（半定量），特異性低；需要參考序列，引物設(shè)計(jì)非常重要；若待測DNA中5mC分布極不均衡，檢測結(jié)果較為復(fù)雜。

四、焦磷酸測序 五、飛行質(zhì)譜法

優(yōu)點(diǎn)：不依賴于限制性位點(diǎn)；分析片段比焦磷酸測序長200-600bp；檢測模板量低至20ng；可確定單一位點(diǎn)甲基化程度；靈敏度可低至5%；

缺點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)有時候較難；硬件昂貴；實(shí)驗(yàn)復(fù)雜、耗時，人為干預(yù)程度高，如PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)空白對照和已知陽性對照，PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜儀進(jìn)行甲基化檢測時設(shè)置完全非甲基化樣本和完全甲基化樣本進(jìn)行對照，需要操作規(guī)范，防止加樣交叉污染等才能確保結(jié)果真實(shí)性；經(jīng)過2次處理，1次酶切，如處理和酶切不完全，則結(jié)果受影響較大。

六、MeDIP-chip/seq

MeDIP-chip

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測；不依賴限制性位點(diǎn)

缺點(diǎn)：抗體和微陣列需求的儀器昂貴；分辨率

MeDIP-seq

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測；分辨率達(dá)到CpG水平；不依賴限制性位點(diǎn)，覆蓋范圍廣；樣本被富集過，導(dǎo)致測序成本低；

缺點(diǎn)：抗體特異性要求高；測序成本高；對于區(qū)分甲基化區(qū)域來說，和同等方法相比不夠強(qiáng)大

靶向甲基化重測序

翼和策略：目標(biāo)區(qū)間甲基化重測序（Hi-MethylSeq）

技術(shù)路線：

優(yōu)勢：Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)多區(qū)段、多位點(diǎn)的甲基化精確定量分析。

應(yīng)用：1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、適用于在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽性位點(diǎn)。

文獻(xiàn)：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160