RNA-BS揭示葉酸調控神經干細胞m5C修飾和mRNA翻譯機制

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葉酸作為一種必需B族維生素，是一種具有重要生物學功能（包括DNA甲基化調控）的甲基供體。正常的神經發育和生理對細胞葉酸水平很敏感，而葉酸缺乏或過量都可能導致神經系統疾病。最近已有研究表明葉酸與哺乳動物線粒體中tRNA m5C修飾和翻譯有關。然而，葉酸攝入對神經元mRNA m5C修飾和翻譯的影響在很大程度上仍然未知。
 
2022年11月23日，美國弗吉尼亞理工大學謝荷煌教授團隊以“Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells”為題在《BMC Biology》雜志上發表研究論文，該研究通過RNA-BS和對應的RNA-seq測序分析揭示了葉酸對小鼠神經干細胞（neural stem cell，NSC）轉錄組范圍內mRNA m5C甲基化和翻譯的作用，并闡明了mRNA m5C甲基化和mRNA翻譯之間的潛在聯系。
標題：Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells（葉酸調節神經干細胞的RNA m5C修飾和翻譯）
時間：2022.11.23
期刊：BMC Biology
影響因子：IF 5.4
技術平臺：RNA-BS、RNA-seq、RT-qPCR、Western blot等
樣本：
從側腦室室管膜下區(SVZ)分離小鼠神經干細胞（NSC），將NSC放置在聚鳥氨酸和層粘連蛋白包被的培養皿中，并在第2天更換培養基將細胞培育4天。根據葉酸（FA）濃度將細胞分為三個處理組：低FA組（LF，1.5μmol/L）、中FA組（MF，10μmol/L）和高FA組（HF，80μmol/L），兩個生物學重復，共6個mRNA-seq文庫和6個mRNA BS-seq文庫。


實驗設計示意圖


研究摘要：
本研究在三種不同濃度的葉酸中培養的NSC顯示出不同的mRNA甲基化譜。盡管只發現了少數差異表達基因，但在葉酸缺乏或補充的神經干細胞（NSC）中發現數百個差異翻譯基因。低濃度葉酸誘導的差異翻譯基因與細胞質翻譯和線粒體功能相關，而高濃度葉酸誘導的差異翻譯基因與神經干細胞增殖增加相關。與總mRNA相比，多聚體mRNA中m5C水平高。此外，綜合分析表明RNA m5C甲基化與mRNA翻譯效率之間存在轉錄特異性關系。
 
研究結果
（1）不同葉酸濃度對小鼠神經干細胞中mRNA豐度的影響

小鼠NSC培養物用神經祖細胞標記物Nestin(細胞質，綠色)和Sox2(細胞核，紅色)染色，并用DAPI(細胞核，藍色)復染

圖1：葉酸對NSC中mRNA豐度的影響。火山圖顯示LF與MF（左）和HF與MF（右)
 
 
（2）小鼠神經干細胞的整體m5C mRNA圖譜
圖2：mRNA BS-seq數據集中高置信度m5C位點表征。

1. 兩個重復之間m5C位點重疊維恩圖。
2. 兩個重復之間重疊m5C位點的甲基化水平相關性點圖。
3. 兩個重復中重疊和非重疊m5C位點甲基化水平箱線圖。

圖3：m5C修飾在小鼠神經干細胞總mRNA中的分布。
a-b.  NSC中m5C位點(a)和m5C修飾(b)的mRNA占總mRNA的數量條形圖。
c.    NSC中總mRNA中m5C位點的甲基化水平箱線圖。
d.    NSC中總mRNA中m5C位點附近序列標記。
e.    m5C位點沿mRNA轉錄本(5'UTR、CDS、3'UTR)分布密度圖。顯示mRNA m5C位點百分比的移動平均值。
f.     三種不同濃度葉酸條件下(LF、MF、HF) m5C位點重疊維恩圖。
g.    m5C修飾的mRNA在LF、MF和HF中的GO分析氣泡圖


（3）葉酸以劑量依賴性方式誘導mRNA翻譯變化
圖4：葉酸缺乏和補充影響NSC的mRNA翻譯。
a-b.  分離無核糖體和結合核糖體RNA的蔗糖梯度示意圖(a)和254nm下記錄的代表性polysome圖譜(1.5μM FA，replicate 1)的部分polysome (9-15部分)(b)。
c.    LF和MF之間的差異翻譯基因(DTGs)的比較火山圖。
d.    HF和MF之間差異翻譯基因(DTGs)的比較火山圖。
e.    DTGs的GO分析氣泡圖，LF的翻譯效率降低(LF vs MF下調)，HF的翻譯效率降低(HF vs MF下調)，HF的翻譯效率增加(HF vs MF上調)

（4）葉酸誘導polysome mRNA m5C甲基化水平變化
圖5：葉酸對小鼠NSC polysome mRNA m5C甲基化的影響。

1. Polysome mRNA中m5C位點附近序列的序列頻率標志。
2. m5C位點沿mRNA轉錄本（5′UTR、CDS、3′UTR）分布密度圖。顯示百分比的移動平均值。
3. Polysome mRNA中m5C位點甲基化水平方框圖。
4. pMF和pLF之間差異甲基化m5C位點的甲基化水平比較熱圖。兩個生物學重復（R1、R2）。
5. pMF和pHF之間差異甲基化m5C位點的甲基化水平的比較熱圖。兩個生物學重復（R1、R2）。
6. pMF vs pLF和pMF vs pHF mRNA DMS修飾的GO注釋。

（5）m5C修飾與mRNA翻譯相關性

圖6：m5C甲基化與mRNA翻譯相關性。
a–c.   總mRNA和Polysome mRNA之間的差異甲基化的m5C位點甲基化譜熱圖。
d–f.   總mRNA和Polysome mRNA之間的差異表達基因（DEG）Volcano圖。
g–i.   m5C甲基化水平顯著變化的mRNA分布，分三類：m5C甲基化與mRNA翻譯效率之間的正相關、負相關和中性相關。
j.     不同m5C甲基化mRNA翻譯相關類別位點分布的堆積條形圖。
k.    三種不同葉酸濃度條件下m5C甲基化和mRNA翻譯之間具有一致正/負/中性相關性的轉錄本匯總表。


研究結論
本研究通過RNA-BS和RNA-seq聯合分析表明了葉酸對NSC轉錄組范圍內mRNA m5C甲基化和翻譯的作用，并揭示了mRNA m5C甲基化和mRNA翻譯之間的潛在聯系。m5C甲基化調控mRNA翻譯的機制值得使用體內模型進行進一步研究。


參考文獻：
Xu X, Johnson Z, Wang A, Padget RL, Smyth JW, Xie H. Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells. BMC Biol. 2022 Nov 23;20(1):261.