scRNA-seq及DAP-seq技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用揭示比克氏棉色素腺的發(fā)育及轉(zhuǎn)錄調(diào)控

2023年2月9日，浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院的最新研究成果，發(fā)表在Molecular Plant期刊上(影響因子21.949)，文章題目為“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in Gossypium bickii”。該研究使用DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了比克氏棉子葉GoPGF的結(jié)合基序和下游靶基因。并進(jìn)一步揭示了比克氏棉色素腺形態(tài)建成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為培育具有特定性狀的栽培棉花新品種提供了寶貴的基因資源。

從萌發(fā)的比克氏棉子葉中分離原生質(zhì)體，進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），保留了12222個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用于下游分析。聚類(lèi)為14個(gè)不同的細(xì)胞簇，這些細(xì)胞在已知的細(xì)胞標(biāo)記基因的輔助下被分為8個(gè)細(xì)胞類(lèi)群，包括：葉肉細(xì)胞(MC)、色素腺細(xì)胞(PG)、表皮細(xì)胞(EC)、保衛(wèi)細(xì)胞(GC)、木質(zhì)部細(xì)胞(XC)、原形成層細(xì)胞(PC)、韌皮部薄壁細(xì)胞(PP)和伴胞(CC)。色素腺細(xì)胞群與其他細(xì)胞群的分離效果良好，并進(jìn)一步分為色素腺薄壁細(xì)胞、分泌細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。隨后，通過(guò)分析3種色素腺細(xì)胞的連續(xù)分化軌跡，初步闡明了色素腺的發(fā)育模式。

圖1. 棉花子葉單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建

轉(zhuǎn)錄因子是植物所有生物過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括色素腺的形成。在色素腺細(xì)胞中鑒定的轉(zhuǎn)錄因子，大多數(shù)與色素腺薄壁細(xì)胞的分化有關(guān)，包括bHLH、AP2/ERF、C2H2、GRAS、NAC和WRKY。從薄壁細(xì)胞向分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變受AP2/ERFs和WRKYs的調(diào)控，而從分泌細(xì)胞向凋亡細(xì)胞的轉(zhuǎn)變受MYBs的調(diào)控。GoPGF是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子，已被證明在色素腺薄壁細(xì)胞起始中發(fā)揮重要作用，但調(diào)控色素腺形態(tài)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。采用DAP-seq分析對(duì)GoPGF下游靶基因進(jìn)行鑒定，并通過(guò)整合DAP-seq和scRNA-seq的結(jié)果，構(gòu)建了一個(gè)以GoPGF為hub基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖2. 調(diào)節(jié)色素腺細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)

接下來(lái)，利用病毒介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)對(duì)8個(gè)與色素腺形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因沉默，其中包括3個(gè)新基因GbiERF114（AP2/ERF），GbiZAT11（C2H2）和GbiNTL9（NAC），以及5個(gè)已知的同源基因GbiCGF1(bHLH)，GbiGoPGF(bHLH)，GbiGoSPGF(GRAS)，GbiCGP1(MYB)和GbiCGF2(NAC)，這些基因的沉默顯著影響幼苗葉片和莖中色素腺的發(fā)育及其棉酚含量。因此，這些類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子可能在棉花色素腺的形成中起重要作用。通過(guò)功能富集分析、順式調(diào)節(jié)元件分析，還發(fā)現(xiàn)光和赤霉素可以促進(jìn)色素腺的形成。

圖3. 轉(zhuǎn)錄因子在色素腺發(fā)育中的功能驗(yàn)證

小結(jié)：該研究整合了色素腺細(xì)胞的發(fā)育軌跡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和核心轉(zhuǎn)錄因子的功能驗(yàn)證，提出了一個(gè)相對(duì)完整的色素腺形態(tài)建成模型。同時(shí)，解析了GoPGF和其他轉(zhuǎn)錄因子在色素腺形成中的作用機(jī)制。此外，還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與色素腺體形成相關(guān)的功能基因（GbiERF114、GbiZAT11、GbiNTL9）以及光和赤霉素促進(jìn)色素腺形成這一現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)為棉花色素腺的形態(tài)建成提供了新的見(jiàn)解，為栽培棉花新品種培育提供了珍貴的基因資源。