DAP-seq技術在金銀花綠原酸生物合成和苯丙素代謝機制研究中的應用

綠原酸(CGA)是灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides，別稱：金銀花)最重要的活性藥物成分，在醫學領域對天然CGA的需求急劇增長。雖然CGA生物合成的關鍵基因已有報道，但其轉錄調控機制在很大程度上仍然是未知的。因此，研究CGA生物合成的分子調控機制對于利用基因工程技術培育高CGA含量的金銀花新品種具有重要意義。

2021年4月29日，重慶文理學院園林與生命科學學院陳澤雄教授的研究成果，發表在植物科學領域的知名學術期刊Plant Science上，文章題目為“A R2R3-MYB transcriptional activator LmMYB15 regulates chlorogenic acid biosynthesis and phenylpropanoid metabolism in Lonicera macranthoides”，該期刊的影響因子為5.363。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq) 技術鑒定了金銀花R2R3-MYB轉錄因子LmMYB15的DNA結合基序及其靶基因。進一步研究揭示了LmMYB15調控金銀花CGA生物合成和苯丙素代謝的分子機制，該研究成果為利用基因工程策略開發富含CGA的金銀花新品種提供了寶貴的基因資源。

該研究首先通過對金銀花不同發育時期的不同組織進行質譜檢測和轉錄圖譜分析，發現LmMYB3、LmMYB4、LmMYB15和LmMYB31基因與CGA的含量存在顯著的相關性，表明這些基因在調控CGA生物合成中發揮潛在作用。LmMYB15和其他MYBs蛋白質的系統發育樹分析結果表明，LmMYB15與紅花CtMYB1、擬南芥AtMYB15和AtMYB14、番茄SlMYB15和菊花CmMYB15具有相近的同源性。酵母雙雜交試驗表明LmMYB15可作為轉錄激活因子。在煙草中過表達LmMYB15基因，促使CGA的含量顯著增加，表明LmMYB15是CGA生物合成的正調控因子。

圖1. DAP-seq分析鑒定全基因組范圍的LmMYB15靶基因

(A) LmMYB15結合的peaks在基因組上的分布分析。(B) 通過MEME-Chip分析篩選LmMYB15的DNA結合基序，其中(C/T) (C/T) (C/T) ACCTA(C/A) (C/T) (A/T) (即YYYACCTAMYW) 和 (C/T)ACCTA(C/A)(即YACCTAM)為最集中富集的2個基序。

為了闡明LmMYB15的分子機制，采用DAP-seq技術鑒定了LmMYB15的DNA結合基序及其直接的下游靶基因，包括4CL、MYB3、MYB4、KNAT6/7、IAA26和ETR2等。酵母單雜交和雙熒光素酶報告基因實驗證實，LmMYB15可以結合4CL、MYB3和MYB4的啟動子，并激活這些基因的表達，從而促進CGA的生物合成和苯丙素代謝。該研究揭示了一種LmMYB15調控金銀花CGA生物合成的新的分子機制，同時為高CGA含量的金銀花育種策略提供了新途徑，這對于提高金銀花的藥用性能具有重要意義。

圖2. LmMYB15正向調控CGA生物合成的分子機制模式圖

總結：該研究從金銀花中分離到一個R2R3 MYB轉錄因子LmMYB15，它是CGA生物合成的正調控因子，它直接與下游靶基因的啟動子結合，包括4CL、MYB3和MYB4，從而促進CGA的積累和苯丙素代謝。該研究為CGA生物合成的轉錄調控機制提供了新見解，同時為培育具有更高藥用價值的高CGA含量金銀花新品種提供了新的策略。