DAP-seq技術在硝酸鹽誘導百脈根根瘤衰老新機制研究中的應用

豆科植物通過與根瘤菌共生，形成能夠固氮的根瘤。硝酸鹽能夠影響根瘤共生的過程，適宜濃度的硝酸鹽促進結瘤固氮，而高濃度的硝酸鹽抑制菌根共生，并且會促進根瘤衰老。NLP (NIN-Like Protein)轉錄因子調控硝酸鹽信號轉導，百脈根NLP1與NLP4的缺失，能夠有效緩解高濃度硝酸鹽對菌根共生和固氮的抑制作用。然而，NLP調控根瘤固氮與根瘤衰老的分子機制需要進一步研究。

2023年3月22日，華中農業大學端木德強課題組的最新研究成果，發表在New Phytologist期刊上(影響因子10.323)，文章題目為“A transcription factor of the NAC family regulates nitrate-induced legume nodule senescence”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了豆科模式植物百脈根中一個NAC轉錄因子的結合基序和靶基因，揭示了NAC094在硝酸鹽誘導的根瘤衰老過程中發揮重要的調控作用，為培育具備高效氮利用特性的農作物新品種奠定了重要基礎。

本研究采用高濃度硝酸鹽處理百脈根，對根瘤樣品進行轉錄組測序分析，與已有的兩個根瘤早衰突變體轉錄組數據進行聯合分析，鑒定到一個轉錄因子Lj2g3v1058050，該基因受硝酸鹽誘導上調表達，并且在早衰根瘤突變體中顯著上調表達。該基因編碼一個NAC轉錄因子，與擬南芥ANAC094同源，將其命名為LjNAC094。

圖1. NAC094的鑒定與表達模式分析

對NAC094的過表達株系（NAC094-OE）進行表型分析，發現過表達NAC094顯著促進了根瘤衰老。過表達株系的轉錄組數據顯示，NAC094調控的基因與硝酸鹽響應基因具有高度一致性。

圖2. NAC094過表達導致根瘤早衰表型

通過DAP-seq技術鑒定了NAC094在全基因組上的調控靶基因。利用EMSA以及轉錄激活實驗對衰老相關基因(SAGs)進行互作驗證。溶菌酶(LYS)與半胱氨酸蛋白酶(CYPs)參與了根瘤衰老過程中蛋白質的降解和細胞裂解過程。銅轉運蛋白(COPT)和肽轉運蛋白(PTR)參與了根瘤衰老過程中營養物質的回收利用。

圖3. DAP-seq鑒定NAC094調控的靶基因

NAC094的缺失能夠緩解硝酸鹽誘導的豆血紅蛋白的降解，同時阻斷了根瘤中由硝酸鹽誘導的衰老相關基因的上調表達。這說明NAC094對于衰老相關基因的表達至關重要。對nlp1、nlp4和nlpl nlp4突變體根瘤進行硝酸鹽處理，發現NLP1/NLP4的缺失，抑制了硝酸鹽誘導的NAC094及其靶基因的表達。這說明NAC094位于NLP1和NLP4的下游。

代謝組學結果顯示，在硝酸鹽處理后的野生型根瘤中，多種二肽和核苷酸分子水平升高，而在nac094突變體根瘤中沒有顯著變化。一些磷脂分子在處理后的野生型根瘤中的含量顯著降低，而在nac094突變體根瘤中變化并不明顯。與轉錄組數據聯合分析發現，編碼蛋白酶、肽酶、核酸酶以及磷脂酶的相關基因受硝酸鹽誘導表達上調，并在過表達NAC094的根瘤中顯著上調表達，這些基因可能參與了根瘤衰老過程中的蛋白、多肽、核酸與磷脂的代謝過程。

圖4. NAC094參與硝酸鹽誘導根瘤衰老的工作機制模型

綜上所述，在硝酸鹽誘導的根瘤衰老過程中，NAC094正調控根瘤衰老，位于NLP1/NLP4的下游，通過激活衰老相關基因參與調控硝酸鹽誘導的根瘤衰老過程。這些衰老相關基因參與細胞裂解、蛋白與核酸水解。該研究利用多組學數據，闡明了根瘤衰老的信號轉導和物質代謝途徑。

論文鏈接：https://doi.org/10.1111/nph.18896