基于動(dòng)態(tài)DNA甲基化圖譜觀察脂肪形成過程中的細(xì)胞譜系特異性發(fā)育
2016年10月，溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（生命科學(xué)學(xué)院）丁春明研究員及團(tuán)隊(duì)在《Molecular Metabolism》雜志發(fā)表題為“Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis”的研究文章，該研究通過簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）及對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）揭示了脂肪形成過程中棕色細(xì)胞（BAT）和白色細(xì)胞（WAT）的特異性發(fā)育。
標(biāo)題：Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis基于動(dòng)態(tài)DNA甲基化圖譜觀察脂肪形成過程中棕色和白色細(xì)胞的特異性
時(shí)間：2016-10
期刊：Molecular Metabolism
影響因子：IF 8.568
技術(shù)平臺(tái)：RRBS、RNA-seq、qPCR等
研究目的：
白色脂肪組織(white adipose tissues，WAT)主要是在饑餓期間以甘油三酯的形式儲(chǔ)存能量以提供燃料，而棕色脂肪組織(brown adipose tissues，BAT)則是非寒戰(zhàn)產(chǎn)熱的主要器官，最近研究也表明了第三種脂肪細(xì)胞的存在，即米色脂肪細(xì)胞。為闡明WAT和BAT細(xì)胞譜系特異性發(fā)育的分子機(jī)制被視為脂肪生物學(xué)研究的關(guān)鍵領(lǐng)域，本研究分析了WAT和BAT在分化過程中的DNA甲基化組，并認(rèn)為DNA甲基化可能是確定脂肪細(xì)胞譜系中一個(gè)穩(wěn)定的表觀遺傳因素。
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
（1）樣本選取：
以從BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)脂肪組織中分離出的WAT和BAT為樣本。
（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）脂肪形成模型的DNA甲基化概況
從8只BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)的脂肪組織中分離出WAT和BAT，并用去甲腎上腺素(NE)處理WAT5天，用NE急性處理BAT4小時(shí)，以誘導(dǎo)關(guān)鍵標(biāo)記物的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各模型在不同分化階段的泛成脂標(biāo)記(AdipoQ、Fabp4、Pparg)和特異性標(biāo)記(Pgc1a、Ucp1、Cidea)的表達(dá)，驗(yàn)證各模型的生物學(xué)有效性。此外，為探究DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組可能編碼的生物信息，研究人員對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了主成分分析和層次聚類，揭示了樣品的分化狀態(tài)與脂質(zhì)代謝的功能專一化有關(guān)。值得注意的是，WAT和BAT的NE處理并沒有改變它們基于DNA甲基化的聚類模式。因此，研究人員認(rèn)為DNA甲基化標(biāo)記代表了不同細(xì)胞系穩(wěn)定的表觀遺傳標(biāo)記。
（2）DNA甲基化組在脂肪形成過程中的變化
在單個(gè)CpG和基因組水平的分化過程中檢測(cè)DNA甲基化譜的變化。首先，所有被分析的CpG被分為低甲基化(LM)、部分甲基化(PM)和高甲基化(HM)三類。在WAT和BAT形成過程中，LM的CpGs降低，而PM和HM的CpGs相應(yīng)增加。對(duì)每個(gè)CpG甲基化差異的評(píng)估顯示，高甲基化CpG的豐度始終高于低甲基化CpG。這表明，在WAT和BAT脂肪形成過程中DNA甲基化的整體增加。盡管大多數(shù)顯著差異甲基化的CPG(DMC)位于內(nèi)含子和基因間區(qū)域，但高甲基化的CPG在啟動(dòng)子區(qū)域最為顯著。有趣的是，WAT和BAT形成過程中顯著差異甲基化啟動(dòng)子(DMP)的獨(dú)立功能富集分析(第0天和第4天)顯示，細(xì)胞增殖和分化顯著富集。
（3）BAT和WAT在脂肪形成過程中的系統(tǒng)差異
BAT和WAT的時(shí)間匹配比較顯示高甲基化的CPG明顯高于低甲基化的CPG。與脂肪形成時(shí)間過程分析的結(jié)果相似，顯著甲基化CPG(DMCs)大多位于內(nèi)含子或基因間區(qū)域。然而，與脂肪形成時(shí)間過程分析不同的是，低甲基化DMC(相對(duì)于WAT)在外顯子區(qū)域占主導(dǎo)地位。
（4）啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)普遍呈負(fù)相關(guān)
本研究從RNA-seq數(shù)據(jù)中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因分別在線粒體呼吸鏈和脂質(zhì)代謝過程中顯著富集，相對(duì)于成熟WAT，成熟BAT中GO的最高上調(diào)為線粒體呼吸鏈和脂肪酸氧化。在比較WAT和BAT兩種類型以及不同時(shí)間形成脂肪的細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)呈整體負(fù)相關(guān)。
（5）Hox家族基因在棕色和白色脂肪形成中甲基化的差異一致
當(dāng)比較BAT和WAT在脂肪形成的所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了31個(gè)DNA甲基化顯著變化的基因，WAT與BAT相比，分別有23個(gè)高甲基化和8個(gè)低甲基化，其中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子Hox家族基因顯著富集，包括Hoxa2、Hoxa5、Hoxc4、Hoxc9和Hoxc10。Hox基因成員是轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)超家族，在序列和功能上都高度保守。有趣的是，對(duì)于所有這5個(gè)Hox基因，RNA-seq的基因表達(dá)與甲基化模式呈負(fù)相關(guān)。Hoxa2、Hoxa5和Hoxc4在BAT中富集，這與它們的高甲基化是一致的，而Hoxc9和Hoxc10在BAT中表達(dá)較低，這與它們的低甲基化是一致的。
為了測(cè)試這些基因在小鼠和人類之間的表達(dá)模式是否保守，本研究檢查了從成人皮下和胎兒棕色脂肪中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)。與小鼠體外和體內(nèi)模型一致，Hoxc9和Hoxc10在人類中表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)。
（6）5- Aza-cytidine對(duì)Hox基因啟動(dòng)子DNA甲基化的抑制可上調(diào)基因表達(dá)
最后，研究在甲基化阻斷劑5-Aza-cytidine的作用下誘導(dǎo)白色和棕色前脂肪細(xì)胞分化五天。在5- Aza-cytidine誘導(dǎo)的去甲基化過程中，Hoxa2和Hoxa5在其啟動(dòng)子高甲基化的WAT中顯著上調(diào)，而在其啟動(dòng)子低甲基化的BAT中則不上調(diào)。Hoxc9和Hoxc10在BAT中的上調(diào)程度高于WAT，可能與它們?cè)贐AT中的高甲基化有關(guān)。Hoxc10被選擇作進(jìn)一步分析，因?yàn)樗谌ゼ谆瘯r(shí)表現(xiàn)出最顯著的表達(dá)變化，最近的數(shù)據(jù)表明它是WAT中BAT標(biāo)記物表達(dá)的抑制因子。在另一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，用5-Aza處理分化成熟的棕色脂肪細(xì)胞3天，在這兩種情況下都檢測(cè)到Hoxc10的上調(diào)，這表明去甲基化導(dǎo)致Hoxc10上調(diào)可能是一種因果作用，與分化過程無關(guān)。
關(guān)鍵圖形
Figure 3: Promoter methylation differences for five Hox genes were associated with gene expression differences between white and brown adipocytes during adipogenesis.
Figure 4: Inhibition of DNA methylation in Hox gene promoters by 5 Aza-cytidine treatment alters gene expression.
結(jié)論
本研究通過RRBS、RNA-seq等組學(xué)分析表明，DNA甲基化是分化前、分化過程中和分化后棕色和白色細(xì)胞譜系的穩(wěn)定表觀遺傳特征。本研究共鑒定出31個(gè)基因的啟動(dòng)子在分化的所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在白色和棕色脂肪形成之間的顯著差異甲基化。其中五個(gè)基因?qū)儆贖ox家族，其表達(dá)水平與啟動(dòng)子甲基化呈負(fù)相關(guān)，表明DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。用5- Aza-cytidine阻斷DNA甲基化導(dǎo)致這些基因表達(dá)上調(diào)，對(duì)Hoxc10（BAT標(biāo)記物表達(dá)抑制因子）具有顯著作用。總之，研究數(shù)據(jù)表明，DNA甲基化可能在脂肪細(xì)胞的譜系特異性發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
參考文獻(xiàn)：
Lim YC, Chia SY, Jin S, Han W, Ding C, Sun L. Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis. Mol Metab. 2016 Oct;5(10):1033-1041.
標(biāo)題：Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis基于動(dòng)態(tài)DNA甲基化圖譜觀察脂肪形成過程中棕色和白色細(xì)胞的特異性時(shí)間：2016-10
期刊：Molecular Metabolism
影響因子：IF 8.568
技術(shù)平臺(tái)：RRBS、RNA-seq、qPCR等
研究目的：
白色脂肪組織(white adipose tissues，WAT)主要是在饑餓期間以甘油三酯的形式儲(chǔ)存能量以提供燃料，而棕色脂肪組織(brown adipose tissues，BAT)則是非寒戰(zhàn)產(chǎn)熱的主要器官，最近研究也表明了第三種脂肪細(xì)胞的存在，即米色脂肪細(xì)胞。為闡明WAT和BAT細(xì)胞譜系特異性發(fā)育的分子機(jī)制被視為脂肪生物學(xué)研究的關(guān)鍵領(lǐng)域，本研究分析了WAT和BAT在分化過程中的DNA甲基化組，并認(rèn)為DNA甲基化可能是確定脂肪細(xì)胞譜系中一個(gè)穩(wěn)定的表觀遺傳因素。
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
（1）樣本選取：
以從BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)脂肪組織中分離出的WAT和BAT為樣本。
（2）項(xiàng)目設(shè)計(jì)流程圖：
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）脂肪形成模型的DNA甲基化概況
從8只BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)的脂肪組織中分離出WAT和BAT，并用去甲腎上腺素(NE)處理WAT5天，用NE急性處理BAT4小時(shí)，以誘導(dǎo)關(guān)鍵標(biāo)記物的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各模型在不同分化階段的泛成脂標(biāo)記(AdipoQ、Fabp4、Pparg)和特異性標(biāo)記(Pgc1a、Ucp1、Cidea)的表達(dá)，驗(yàn)證各模型的生物學(xué)有效性。此外，為探究DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組可能編碼的生物信息，研究人員對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了主成分分析和層次聚類，揭示了樣品的分化狀態(tài)與脂質(zhì)代謝的功能專一化有關(guān)。值得注意的是，WAT和BAT的NE處理并沒有改變它們基于DNA甲基化的聚類模式。因此，研究人員認(rèn)為DNA甲基化標(biāo)記代表了不同細(xì)胞系穩(wěn)定的表觀遺傳標(biāo)記。
（2）DNA甲基化組在脂肪形成過程中的變化
在單個(gè)CpG和基因組水平的分化過程中檢測(cè)DNA甲基化譜的變化。首先，所有被分析的CpG被分為低甲基化(LM)、部分甲基化(PM)和高甲基化(HM)三類。在WAT和BAT形成過程中，LM的CpGs降低，而PM和HM的CpGs相應(yīng)增加。對(duì)每個(gè)CpG甲基化差異的評(píng)估顯示，高甲基化CpG的豐度始終高于低甲基化CpG。這表明，在WAT和BAT脂肪形成過程中DNA甲基化的整體增加。盡管大多數(shù)顯著差異甲基化的CPG(DMC)位于內(nèi)含子和基因間區(qū)域，但高甲基化的CPG在啟動(dòng)子區(qū)域最為顯著。有趣的是，WAT和BAT形成過程中顯著差異甲基化啟動(dòng)子(DMP)的獨(dú)立功能富集分析(第0天和第4天)顯示，細(xì)胞增殖和分化顯著富集。
（3）BAT和WAT在脂肪形成過程中的系統(tǒng)差異
BAT和WAT的時(shí)間匹配比較顯示高甲基化的CPG明顯高于低甲基化的CPG。與脂肪形成時(shí)間過程分析的結(jié)果相似，顯著甲基化CPG(DMCs)大多位于內(nèi)含子或基因間區(qū)域。然而，與脂肪形成時(shí)間過程分析不同的是，低甲基化DMC(相對(duì)于WAT)在外顯子區(qū)域占主導(dǎo)地位。
（4）啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)普遍呈負(fù)相關(guān)
本研究從RNA-seq數(shù)據(jù)中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因分別在線粒體呼吸鏈和脂質(zhì)代謝過程中顯著富集，相對(duì)于成熟WAT，成熟BAT中GO的最高上調(diào)為線粒體呼吸鏈和脂肪酸氧化。在比較WAT和BAT兩種類型以及不同時(shí)間形成脂肪的細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)呈整體負(fù)相關(guān)。
（5）Hox家族基因在棕色和白色脂肪形成中甲基化的差異一致
當(dāng)比較BAT和WAT在脂肪形成的所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了31個(gè)DNA甲基化顯著變化的基因，WAT與BAT相比，分別有23個(gè)高甲基化和8個(gè)低甲基化，其中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子Hox家族基因顯著富集，包括Hoxa2、Hoxa5、Hoxc4、Hoxc9和Hoxc10。Hox基因成員是轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)超家族，在序列和功能上都高度保守。有趣的是，對(duì)于所有這5個(gè)Hox基因，RNA-seq的基因表達(dá)與甲基化模式呈負(fù)相關(guān)。Hoxa2、Hoxa5和Hoxc4在BAT中富集，這與它們的高甲基化是一致的，而Hoxc9和Hoxc10在BAT中表達(dá)較低，這與它們的低甲基化是一致的。
為了測(cè)試這些基因在小鼠和人類之間的表達(dá)模式是否保守，本研究檢查了從成人皮下和胎兒棕色脂肪中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)。與小鼠體外和體內(nèi)模型一致，Hoxc9和Hoxc10在人類中表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)。
（6）5- Aza-cytidine對(duì)Hox基因啟動(dòng)子DNA甲基化的抑制可上調(diào)基因表達(dá)
最后，研究在甲基化阻斷劑5-Aza-cytidine的作用下誘導(dǎo)白色和棕色前脂肪細(xì)胞分化五天。在5- Aza-cytidine誘導(dǎo)的去甲基化過程中，Hoxa2和Hoxa5在其啟動(dòng)子高甲基化的WAT中顯著上調(diào)，而在其啟動(dòng)子低甲基化的BAT中則不上調(diào)。Hoxc9和Hoxc10在BAT中的上調(diào)程度高于WAT，可能與它們?cè)贐AT中的高甲基化有關(guān)。Hoxc10被選擇作進(jìn)一步分析，因?yàn)樗谌ゼ谆瘯r(shí)表現(xiàn)出最顯著的表達(dá)變化，最近的數(shù)據(jù)表明它是WAT中BAT標(biāo)記物表達(dá)的抑制因子。在另一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，用5-Aza處理分化成熟的棕色脂肪細(xì)胞3天，在這兩種情況下都檢測(cè)到Hoxc10的上調(diào)，這表明去甲基化導(dǎo)致Hoxc10上調(diào)可能是一種因果作用，與分化過程無關(guān)。
關(guān)鍵圖形
Figure 3: Promoter methylation differences for five Hox genes were associated with gene expression differences between white and brown adipocytes during adipogenesis.Figure 4: Inhibition of DNA methylation in Hox gene promoters by 5 Aza-cytidine treatment alters gene expression.結(jié)論
本研究通過RRBS、RNA-seq等組學(xué)分析表明，DNA甲基化是分化前、分化過程中和分化后棕色和白色細(xì)胞譜系的穩(wěn)定表觀遺傳特征。本研究共鑒定出31個(gè)基因的啟動(dòng)子在分化的所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在白色和棕色脂肪形成之間的顯著差異甲基化。其中五個(gè)基因?qū)儆贖ox家族，其表達(dá)水平與啟動(dòng)子甲基化呈負(fù)相關(guān)，表明DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。用5- Aza-cytidine阻斷DNA甲基化導(dǎo)致這些基因表達(dá)上調(diào)，對(duì)Hoxc10（BAT標(biāo)記物表達(dá)抑制因子）具有顯著作用。總之，研究數(shù)據(jù)表明，DNA甲基化可能在脂肪細(xì)胞的譜系特異性發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
參考文獻(xiàn)：
Lim YC, Chia SY, Jin S, Han W, Ding C, Sun L. Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis. Mol Metab. 2016 Oct;5(10):1033-1041.
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