DAP-seq技術(shù)應(yīng)用于鑒定玉米ZmR1的靶基因及對(duì)花青素合成調(diào)控的研究

花青素(Anthocyanidin)是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物。水果、蔬菜、花卉的顏色大部分與之有關(guān)�；ㄇ嗨啬軌蛱岣咧参镉^賞價(jià)值，花青素的抗氧化功能對(duì)人體健康有積極作用�；ㄇ嗨匾驯挥糜诮】笛a(bǔ)充劑的成分。因此，培育高含量花青素的植物是一個(gè)重要目標(biāo)。

近日，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、齊魯師范大學(xué)玉米分子育種研究院的共同研究成果，于2022年7月5日在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Theoretical and Applied Genetics上發(fā)表(影響因子為5.574)，題目為“ A newly characterized allele of ZmR1 increases anthocyanin content in whole maize plant and the regulation mechanism of diferent ZmR1 alleles”。本文主要研究?jī)?nèi)容是鑒定了玉米花青素合成相關(guān)等位基因ZmR1^CQ01，并揭示了3個(gè)ZmR1等位基因的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制。

研究背景：
玉米中的花青素對(duì)人類的健康具有積極作用。R1基因家族調(diào)控花青素的組織特異性分布。R1基因的等位基因變異較為豐富，然而其生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

研究材料：
玉米自交系 CQ01、ZN3、B73、B104、WMR，京紫糯219 (ZN3×CQ01)，京724，京92、京科968 (京724×京92)，B73 zmr1 EMS突變體，以及本研究中用到的多個(gè)遺傳材料。

研究結(jié)果：
CQ01玉米植株的多種器官(葉鞘、葉脈、苞片、葉、莖、種子皮、支撐根等) 中都存在花青素色素沉著現(xiàn)象。然而B(niǎo)73植株的花青素主要積累在近地葉鞘和支撐根中。

圖1：玉米自交系CQ01葉片中脈花青素含量和成分分析以及花青素調(diào)控基因的定位

(a)玉米自交系CQ01和B73的葉中脈。(b) CQ01生長(zhǎng)30天后葉中脈的花青素含量。(c) LC-MS/MS在不同掃描波長(zhǎng)下的信號(hào)強(qiáng)度。(d) LC-MS/MS檢測(cè)花青素的保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度。(e) 花青素組成成分檢測(cè)。(f)BSR-seq分析將花青素調(diào)控基因定位到10號(hào)染色體 (B73 RefGen_v3)。(g) 采用滑動(dòng)窗口法將花青素調(diào)控基因定位到10號(hào)染色體132-140Mb區(qū)間。(h) 利用CQ01(紫色中脈)和ZN3(綠色中脈)之間具有SNP多態(tài)性的13個(gè)KASP分子標(biāo)記，對(duì)465個(gè)京紫糯219 (ZN3×CQ01)的F2代個(gè)體進(jìn)行精細(xì)定位，將葉中脈花青素調(diào)控基因定位于KASP-15和KASP-19標(biāo)記之間的404kb區(qū)間。

通過(guò)CQ01和B73雜交的F2代種群分離實(shí)驗(yàn) (綠色中脈:紫色中脈=1:3) 發(fā)現(xiàn)，CQ01的紫色葉中脈由一個(gè)顯性基因控制。通過(guò)BSR-seq分析及精細(xì)遺傳定位發(fā)現(xiàn)玉米葉中脈的花青素色素沉著由第10號(hào)染色體上的ZmR1基因控制。

圖2：過(guò)表達(dá)ZmR1和過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01的京724的不同組織中花青素的積累

(a) ZmR1過(guò)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。(b) 野生型京724和5個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01的京724(T0代)中花青素積累的表現(xiàn)型。(c-m) 野生型京724和過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01的京724的不同組織中的花青素積累。花青素在玉米粒(c)、胚芽鞘(d和e)、玉米須(f和j)、苞片(f和j)、葉(g和k)、葉中脈(g和k)、葉鞘(h和l)、莖(h和l)、花藥(i和m)和雄花序(i和m)中積累。

ZmR1^CQ01是從紫色玉米中獲得的一個(gè)新的ZmR1等位基因。該基因的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)玉米植株變成紫色。

圖3：玉米zmr1 EMS突變體的等位基因檢測(cè)及ZmR1的亞細(xì)胞定位

(a) 3個(gè)B73 zmr1 EMS突變體的突變位點(diǎn)和核苷酸變異情況。(b) 突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。(c-d) 野生型B73、3個(gè)B73 zmr1 EMS突變體(c)、2個(gè)突變體雜交植株和CQ01(d)的葉鞘中花青素積累的情況。(e) 通過(guò)對(duì)玉米原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)分析ZmR1的亞細(xì)胞定位。

玉米zmr1 EMS突變體的等位基因檢測(cè)表明，葉鞘中的花青素色素沉著也受到ZmR1的控制。

圖4：玉米自交系B73的葉鞘和葉片中花青素的積累和ZmR1的表達(dá)，以及在B104中過(guò)表達(dá)ZmR1^B73后，葉中脈花青素積累增加

(a-b) B73和CQ01在葉鞘(a)和中脈(b)中的花青素積累。(c) B73生長(zhǎng)30天后葉鞘中花青素的含量。(d)在生長(zhǎng)30天的B73、CQ01和B73 zmr1 EMS突變體的葉鞘(靠近地面)、葉片和中脈中ZmR1的表達(dá)水平。(e)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析鑒定生長(zhǎng)30天的CQ01和B73葉中脈中ZmR1的FPKM值。(f) 生長(zhǎng)30天的野生型B104和過(guò)表達(dá)ZmR1^B73的轉(zhuǎn)基因B104中花青素色素沉著的比較。(g-h) 過(guò)表達(dá)ZmR1^B73的轉(zhuǎn)基因B104和過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01的轉(zhuǎn)基因B104在生長(zhǎng)30天時(shí)花青素色素沉著的比較。

ZmR1^B73等位基因調(diào)控花青素在近地葉鞘中積累，而在葉片中脈沒(méi)有積累。ZmR1^B73在中脈的mRNA表達(dá)水平較低，因而沒(méi)有花青素積累。過(guò)表達(dá)ZmR1^B73可以促進(jìn)花青素在中脈的積累。

圖5：ZmR1^ZN3的功能驗(yàn)證和功能分子標(biāo)記物的開(kāi)發(fā)

(a) 花青素不在ZN3的葉鞘和中脈積累。(b) 生長(zhǎng)30天的ZN3和CQ01的葉片、中脈和葉鞘中ZmR1的表達(dá)量比較。(c) 通過(guò)zmr1 EMS突變體等位基因測(cè)試驗(yàn)證ZmR1^ZN3的功能。(d) ZN3和CQ01的序列比對(duì)顯示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個(gè)外顯子。(e) ZmR1可編碼三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中bHLH-MYCN結(jié)構(gòu)域由第5個(gè)外顯子編碼。(f) CQ01、ZN3和京紫糯219 (ZN3×CQ01)中分子標(biāo)記的擴(kuò)增片段大小。CQ01為315 bp，ZN3為272 bp，京紫糯219為272 bp和315 bp。(g) 玉米自交系WMR的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與觀察到的表型一致。利用所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記，對(duì)432個(gè)田間玉米自交系進(jìn)行了鑒定。WMR的擴(kuò)增片段為272 bp。表型分析顯示，WMR的葉鞘和中脈缺乏花青素的積累。

對(duì)ZN3和CQ01的序列比較顯示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個(gè)外顯子，導(dǎo)致ZmR1^ZN3等位基因功能被破壞，因而在中脈和葉鞘中沒(méi)有花青素積累。

圖6：DAP-seq鑒定的ZmR1靶基因和RNA-seq鑒定的差異表達(dá)基因(DEGs)富集的代謝途徑

(a)ZmR1結(jié)合的置信度高的兩種motifs,“GATCAATGGCCA”和“GAGGWGTMBGWG”的motifs E值分別是 4.6e-311和1.3e-268。(b) 由DAP-seq鑒定的ZmR1的靶基因富集的前20個(gè)代謝途徑。(c) RNA-seq分析CQ01和B73的中脈，鑒定了DEGs富集的前20個(gè)代謝途徑。(d) RNA-seq分析野生型和過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01的京724的葉片，鑒定了DEGs富集的前20個(gè)代謝途徑。

DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)結(jié)果顯示，ZmR1^CQ01靶向了1010個(gè)基因，其中包括花青素合成途徑中的Bz2。RNA-seq分析顯示，ZmR1^CQ01靶向的55個(gè)基因的表達(dá)水平顯著改變，其中類黃酮和苯丙素生物合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)顯著上調(diào)。隨后，又開(kāi)發(fā)了ZmR1功能分子標(biāo)記物。以上結(jié)果揭示了轉(zhuǎn)錄調(diào)控和序列變異對(duì)ZmR1功能的影響，并在全基因組水平上鑒定了ZmR1^CQ01的靶基因。

圖7：過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01玉米京724的應(yīng)用

(a) 過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01京724植株由綠色變?yōu)樽仙��?b)過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01京724的紫色玉米將白酒變?yōu)榧t色。(c) 過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01京724和京92雜交得到的田間玉米雜交種京科968植株是紫色的。

本文小結(jié)：

本研究在玉米自交系CQ01的葉中脈中克隆了新的ZmR1等位基因。通過(guò)利用玉米EMS突變體、過(guò)表達(dá)ZmR1基因、分析序列差異、組織特異性表達(dá)分析、啟動(dòng)子甲基化水平分析、轉(zhuǎn)錄組和DAP-seq結(jié)果，揭示了ZmR1在多種組織中對(duì)花青素分布的影響及其分子調(diào)控機(jī)制。

通過(guò)分子育種策略，可以產(chǎn)生高花青素含量的玉米品系。過(guò)表達(dá)ZmR1^CQ01，獲得了一個(gè)花青素含量高的紫色玉米雜交種京科968。本研究開(kāi)發(fā)的新R等位基因ZmR1^CQ01及其功能分子標(biāo)記，可通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種用于高花青素含量玉米新品種的遺傳改良和分子設(shè)計(jì)育種。