文獻科普：m6A甲基化修飾在神經(jīng)元發(fā)育和成體神經(jīng)形成中的作用研究
近年來研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的mRNA中普遍存在，并在胚胎期和產(chǎn)后神經(jīng)元發(fā)育過程中表現(xiàn)出動態(tài)特征。浙江大學醫(yī)學院李學坤教授團隊多組學聯(lián)合分析揭示了m6A修飾通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調(diào)控神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育，進一步驗證了m6A甲基化修飾在神經(jīng)元發(fā)育和成體神經(jīng)形成中的作用。
標題：m6A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2（m6A修飾通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調(diào)控神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育）
時間：2019.4
期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics
影響因子：IF 7.691
技術平臺：MeRIP-seq、m6A MeRIP-qPCR、RNA-seq、ChIP
摘要：
m6A甲基化酶由Mettl3和Mettl14組成，是mRNA中最豐富的RNA修飾，參與多種生物過程。然而，m6A修飾在調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育和成體神經(jīng)形成中的作用和確切機制尚不清楚。在本研究種，作者檢測了Mettl3在小鼠神經(jīng)元發(fā)育和成體神經(jīng)形成中的功能，結果發(fā)現(xiàn)Mettl3沉默導致成體神經(jīng)干細胞（adult neural stem cells，ANSC）中m6A修飾水平顯著下調(diào)，并影響了細胞增殖。Mettl3沉默不僅影響神經(jīng)元發(fā)育，使ANSC分化更傾向于膠質(zhì)細胞系，而且還影響了新生神經(jīng)元的形態(tài)成熟。m6A-seq（MeRIP-seq）測序分析結果顯示m6A修飾主要富集在與神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育相關的轉錄本中。從機制上講，m6A修飾存在于組蛋白甲基轉移酶Ezh2的轉錄本上，mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調(diào)，ChIP實驗證明H3K27me3水平下調(diào)。免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，mettl3沉默引起的神經(jīng)細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復。總之，研究結果揭示了RNA修飾和組蛋白修飾之間的串擾，并表明Mettl3介導的m6A修飾通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2表達在調(diào)控成體神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
實驗方法和流程設計
結果
（1）小鼠神經(jīng)干細胞發(fā)育中mettl3的表達動態(tài)
（A-D）神經(jīng)干細胞增殖和分化中mettl3表達動態(tài)的免疫熒光觀察
（E-F）Western blot檢測m6A甲基化酶mettl3和mettl14在增殖和分化中的變化
（I）Dot blot和MS檢測增殖和分化過程中總體m6A修飾水平的變化
（2）m6A甲基化酶mettl3調(diào)控神經(jīng)干細胞增殖
（E-G）免疫熒光觀察：mettl3沉默影響了細胞增殖
（H）RT-PCR檢測mettl3沉默導致多種細胞周期蛋白mRNA水平下調(diào)
（I-K）流式細胞術分析沉默后細胞周期狀態(tài)發(fā)生改變
（3）m6A甲基化酶mettl3調(diào)控神經(jīng)干細胞分化和發(fā)育
（A-E）免疫熒光觀察：mettl3沉默和過表達對神經(jīng)干細胞分化的影響（Tuj1為神經(jīng)元細胞標志物，GFAP為星形膠質(zhì)細胞標志物）
（F-G）Western blot：mettl3沉默和過表達對神經(jīng)干細胞分化的影響
（H-L）Sholl分析檢測mettl3沉默和過表達對新生神經(jīng)元細胞和海馬神經(jīng)元的影響
（I-K）原位電穿孔圖像分析mettl3沉默對神經(jīng)元的數(shù)量和長度的影響
（4）神經(jīng)干細胞從增殖到分化的m6A修飾動態(tài)
（A-B）增殖和分化細胞的m6A修飾在轉錄本上的分布比較
（C）增殖和分化細胞的m6A修飾區(qū)域motif分析
（D）增殖和分化細胞中m6A修飾基因的重疊分析
（E-G）共有基因和獨有基因的GO功能富集分析
（H）m6A修飾基因和差異表達基因的重疊分析
（I）具有m6A修飾的差異表達基因的GO分析
（J）增殖和分化細胞中幾個差異m6A修飾基因的IGV展示
（5）mettl3通過m6A修飾調(diào)節(jié)基因表達，進而影響神經(jīng)細胞增殖
（C）組學關聯(lián)分析火山圖（九象限圖的另一個版本）
（D-E）mettl3沉默后有m6A修飾的上調(diào)和下調(diào)差異表達基因的GO分析
（F）四個與神經(jīng)發(fā)育功能相關基因在mettl3沉默后m6A修飾水平降低
（G）m6A修飾的差異表達基因功能網(wǎng)絡
（6）Ezh2受Mettl3調(diào)控，可挽救Mettl3基因下調(diào)引起的神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生缺陷
（A-C）mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調(diào)，CHIP實驗證明H3K27me3水平下調(diào)。
（D-E）mettl3沉默和Ezh2 m6A修飾區(qū)引入突變，都不影響Ezh2的mRNA水平
（F-I）免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，mettl3沉默引起的神經(jīng)細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復
（D）Ezh2過表達挽救了受損的新生神經(jīng)元的形態(tài)成熟
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.007
標題：m6A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2（m6A修飾通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調(diào)控神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育）
時間：2019.4
期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics
影響因子：IF 7.691
技術平臺：MeRIP-seq、m6A MeRIP-qPCR、RNA-seq、ChIP
摘要：
m6A甲基化酶由Mettl3和Mettl14組成，是mRNA中最豐富的RNA修飾，參與多種生物過程。然而，m6A修飾在調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育和成體神經(jīng)形成中的作用和確切機制尚不清楚。在本研究種，作者檢測了Mettl3在小鼠神經(jīng)元發(fā)育和成體神經(jīng)形成中的功能，結果發(fā)現(xiàn)Mettl3沉默導致成體神經(jīng)干細胞（adult neural stem cells，ANSC）中m6A修飾水平顯著下調(diào)，并影響了細胞增殖。Mettl3沉默不僅影響神經(jīng)元發(fā)育，使ANSC分化更傾向于膠質(zhì)細胞系，而且還影響了新生神經(jīng)元的形態(tài)成熟。m6A-seq（MeRIP-seq）測序分析結果顯示m6A修飾主要富集在與神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育相關的轉錄本中。從機制上講，m6A修飾存在于組蛋白甲基轉移酶Ezh2的轉錄本上，mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調(diào)，ChIP實驗證明H3K27me3水平下調(diào)。免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，mettl3沉默引起的神經(jīng)細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復。總之，研究結果揭示了RNA修飾和組蛋白修飾之間的串擾，并表明Mettl3介導的m6A修飾通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2表達在調(diào)控成體神經(jīng)形成和神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
實驗方法和流程設計
結果
（1）小鼠神經(jīng)干細胞發(fā)育中mettl3的表達動態(tài)
（E-F）Western blot檢測m6A甲基化酶mettl3和mettl14在增殖和分化中的變化
（I）Dot blot和MS檢測增殖和分化過程中總體m6A修飾水平的變化
（2）m6A甲基化酶mettl3調(diào)控神經(jīng)干細胞增殖
（A-B）mettl3沉默實驗：RT-PCR和WB驗證其表達沉默成功
（C-D）Dot blot和MS驗證mettl3沉默導致的m6A修飾水平下調(diào)（E-G）免疫熒光觀察：mettl3沉默影響了細胞增殖
（H）RT-PCR檢測mettl3沉默導致多種細胞周期蛋白mRNA水平下調(diào)
（I-K）流式細胞術分析沉默后細胞周期狀態(tài)發(fā)生改變
（3）m6A甲基化酶mettl3調(diào)控神經(jīng)干細胞分化和發(fā)育
（F-G）Western blot：mettl3沉默和過表達對神經(jīng)干細胞分化的影響
（H-L）Sholl分析檢測mettl3沉默和過表達對新生神經(jīng)元細胞和海馬神經(jīng)元的影響
（I-K）原位電穿孔圖像分析mettl3沉默對神經(jīng)元的數(shù)量和長度的影響
（4）神經(jīng)干細胞從增殖到分化的m6A修飾動態(tài)
（C）增殖和分化細胞的m6A修飾區(qū)域motif分析
（D）增殖和分化細胞中m6A修飾基因的重疊分析
（E-G）共有基因和獨有基因的GO功能富集分析
（H）m6A修飾基因和差異表達基因的重疊分析
（I）具有m6A修飾的差異表達基因的GO分析
（J）增殖和分化細胞中幾個差異m6A修飾基因的IGV展示
（5）mettl3通過m6A修飾調(diào)節(jié)基因表達，進而影響神經(jīng)細胞增殖
（A）mettl3沉默樣本的m6Apeak分布、motif分析
（B）mettl3沉默前后的差異表達基因和m6A修飾基因的重疊分析（C）組學關聯(lián)分析火山圖（九象限圖的另一個版本）
（D-E）mettl3沉默后有m6A修飾的上調(diào)和下調(diào)差異表達基因的GO分析
（F）四個與神經(jīng)發(fā)育功能相關基因在mettl3沉默后m6A修飾水平降低
（G）m6A修飾的差異表達基因功能網(wǎng)絡
（6）Ezh2受Mettl3調(diào)控，可挽救Mettl3基因下調(diào)引起的神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生缺陷
（A-C）mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調(diào)，CHIP實驗證明H3K27me3水平下調(diào)。
（D-E）mettl3沉默和Ezh2 m6A修飾區(qū)引入突變，都不影響Ezh2的mRNA水平
（F-I）免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，mettl3沉默引起的神經(jīng)細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復
（D）Ezh2過表達挽救了受損的新生神經(jīng)元的形態(tài)成熟
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.007
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