WB蛋白樣品制備常見問題及解決方法

一直都在做蛋白研究，但是樣品制備中的小細節你都了解嗎？這里為大家整理了蛋白樣品制備中大大小小的常見問題，一起來學習吧！

Q：貼壁細胞收集是刮下來好還是胰酶消化好？
A：兩種方式都是可行的，各有利弊。不必擔心刮刀收集會刮壞細胞，胰酶消化的程度掌握不好，也會讓細胞破損。胰酶消化可能會對某些膜蛋白產生影響，刮刀收集效率會略低，可根據自己的實驗來選擇細胞收集的方式。做總蛋白提取時，可選擇直接在器皿中進行裂解，無需提前收集。

PS：使用刮刀收集時，可加入PBS幫助收取細胞。

 

Q：所有WB實驗都用總蛋白就可以完成嗎？
A：當然不是，要根據WB的實驗目的來確定提取哪類蛋白，如需驗證某些低豐度蛋白，或蛋白定位，或組分間表達量對比，則需要進行亞細胞結構分離或組分分離。

Q：用RIPA提取總蛋白為什么會有粘稠的不可溶沉淀？是什么？如何解決？
A：產生粘稠物的主要原因是RIPA不能將所有樣品全部裂解，產生的不可溶組分中主要含有核酸殘團，細胞碎片（有些組織樣品還含有油脂），和部分蛋白，因此RIPA提取的僅僅是可溶性蛋白，并非真正的總蛋白。

解決方案：使用柱式法蛋白提取真正意義上的總蛋白

 

Q：不同時間點處理細胞，如何收集進行蛋白提取更合理？
A：最好是收集完細胞后馬上進行蛋白提取。

 

Q：濃度測定哪家強？
A：濃度測定方法很多，目前推薦使用兼容性較好的BCA法進行濃度測定。

 

Q：蛋白樣品如何儲存？
A：蛋白樣品不建議久存，也不要反復凍融。下游做WB實驗，建議蛋白濃度測定后，加入loading buffer煮樣，煮后根據實驗需要分裝成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮樣即可。

 

Q：樣品上樣前怎么處理？
A：蛋白濃度測定后，建議將各個樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可以PBS，水或裂解液），加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分鐘，使蛋白充分變性，也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。

PS：煮沸并非必須步驟，膜蛋白建議70℃或者更低溫度煮。

煮后在冰上靜置少許時間，進行低速離心，即可上樣。

 

Q：組織樣品含血量多可以直接提蛋白嗎？
A：如組織樣品中含血較多，血紅蛋白可能會影響下游實驗， 可以在組織樣品裂解前使用紅細胞裂解液進行處理后，再進行蛋白提取。