RAF、MEK 和 ERK在KRAS 突變型肺癌耐藥性測試中的應用
全球每年大約有 160 萬人死于肺癌，肺癌是目前世界上死亡率最高的癌癥之一。
KRAS 是一種致癌基因，編碼 KRAS 蛋白 (一種 small GTPase 轉導蛋白)。KRAS 通過結合 GTP/GDP 控制其活躍狀態，進而控制其信號傳遞和下游級聯反應。致癌性 KRAS 突變會破壞 GTPase 活性，進而使 KRAS 蛋白鎖定在活躍狀態下，從而使啟動和維持腫瘤發生的信號過度活躍。在此前的《“不可成藥靶點” KRAS：關門才是大吉”》一推文中，我們介紹了 KRAS 的工作機制以及直接靶向 KRAS 蛋白的 AMG 510, MRTX849 等抑制劑。相對于風頭正盛的“直接靶向”，靶向下游的效應因子仍占據 KRAS 突變肺癌靶向治療的重要地位。
KRAS 突變肺癌中，針對關鍵效應因子 (包括 MAPK 通路成分 RAF、MEK 和 ERK) 的策略，受其持續抑制的相關毒性和/或適應性耐藥機制所阻礙。除了開發新的抑制劑和靶點之外，聯合治療成為了克服腫瘤適應性耐藥的首要考慮之一。如何開發這種聯治療方案，紀念斯隆-凱特琳癌癥中心 Scott W. Lowe 教授的團隊在題為 “A combinatorial strategy for treating KRAS-mutant lung cancer” 的文章給我們做了一次經典的“示范”。
研究背景
靶向 KRAS 下游效應因子常由于代償性或平行途徑的激活而受阻，如 KRAS 突變型肺癌對 MEK 抑制的抗性 (耐藥性) 是由受體酪氨酸激酶 (RTK) 信號的反饋激活引起的。該研究中，作者采用系統化的方法來確定 MEK 抑制劑的聯合治療目標。
研究方法
主要細胞系：KRASG12C 突變型肺癌細胞 (H23 和 H2030 細胞系)。
動物模型：KRAS 突變患者來源異種移植小鼠 (A549, H2122 細胞系)，KRASG12D 基因工程小鼠模型 (GEMM)。
主要實驗方法：shRNA 文庫篩選，免疫印跡和 RAS-GTP 檢測，qRT-PCR，micro-CT 技術，免疫組織化學。
研究結果
■ shRNA 篩選鑒定 Trametinib 敏化劑 (Sensitizer)
通過針對 536 種人類激酶的隨機 shRNA 文庫篩選，鑒定出 8 個目標 shRNA，通過 MEK 抑制劑 Trametinib (曲美替尼) 處理，排除 2 個，再通過細胞驗證，確定了 BRAF、CRAF、ERK2 和 FGFR1 為最佳候選基因，這些基因的抑制作用使 KRAS 突變的肺癌細胞對 MEK 抑制劑 Trametinib 敏感。
Trametinib 對 ERK 的反饋再激活有負面影響，但是 MAPK 通路的再激活還是會發生。抑制 ERK 能阻斷 Trametinib 處理后 ERK 信號的反彈，說明了 KRAS 突變腫瘤對 MAPK 信號通路的顯著依賴性。另外，用 Trametinib 處理的 KRAS 突變細胞也顯示 PI3K 和 JAK/STAT 途徑的代償性激活。
■ 抑制 FGFR1 可增強 Trametinib 的作用
已有報道表明，多種受體酪氨酸激酶 (RTKs) 涉及 RAS 通路拮抗劑適應性耐藥。實驗表明，FGFR1 shRNA 不能抑制 KRAS 突變型肺癌的增殖，但與 Trametinib 聯合使用時表現出協同抑制作用。多重激酶抑制劑 Ponatinib (普納替尼) 對 FGFR1 過表達的肺癌有抑制作用，它與 Trametinib 協同抑制細胞增殖，其抑制作用與 p-FRS2 誘導的程度相關。這種協同作用歸功于 Ponatinib 影響 MAPK 和 PI3K 途徑再激活的綜合能力。
圖 4. Trametinib+Ponatinib 抑制 KRAS 突變肺細胞的增殖
另外，抑制 FGFR1 對 Trametinib 的協同作用還具有特異性，例如，與 FGFR1/FRS2有關，而非 FGFR2 或者 FGFR3；對于 KRAS 突變型非癌細胞效果顯著，而 KRAS 野生型肺癌細胞中效果不顯著；在胰腺癌細胞系中具有協同作用，而在大腸癌細胞中無效。重要的是，這種基因型和組織特異性與 Trametinib 單一處理時觸發 FRS2 磷酸化的能力有關。
■ 抑制 MEK/FGFR1 誘導 KRAS 突變的腫瘤消退
KRAS 突變型人源腫瘤異體移植 (PDX) 和 GEMM 小鼠模型中進行驗證，兩種模型顯示結果相似，Trametinib+Ponatinib 處理明顯導致腫瘤消退。此外，他們還檢測了 Trametinib 在 KRAS 突變型腫瘤中誘導 FGFR1 信號傳導的能力。
圖 5. FGFR1 shRNA/Ponatinib+Trametinib 的抗腫瘤作用
KRAS 突變的 PDX 模型顯示，Trametinib 處理后 FRS2, ERK 和 AKT 磷酸化同時增加，但這種作用被 Ponatinib 消除了。
總結：該研究是對解決靶向 KRAS 突變腫瘤耐藥性的探索，從耐藥性相關基因的篩選、細胞驗證到體內小鼠實驗驗證，結合細胞信號通路，最終確定了 FGFR1 信號的反饋激活是 KRAS 突變型肺癌對 Trametinib 的適應性耐藥的重要機制，為 Trametinib 與 FGFR1 抑制劑聯合用于治療 KRAS 突變型肺癌提供了有力的支持。也證明了靶向適應性耐藥機制可以提高分子靶向療法的療效，并為開發治療 KRAS 突變型肺癌的合理策略提供了一條途徑。
繼抗乳腺癌化合物庫上線之后，MCE 又整理了抗肺癌相關化合物庫，現已上線！
|
相關產品 |
| 抗肺癌化合物庫 收錄了 600+ 具有明確或潛在抗肺癌活性的化合物，這些化合物靶向肺癌治療中的關鍵靶點及信號通路。MCE 抗肺癌化合物庫是篩選抗肺癌活性化合物及其他肺癌相關研究的重要工具。 |
|
有效的，具有口服活性的多靶點激酶抑制劑，能抑制 Abl, PDGFRα, VEGFR2, FGFR1 和 Src。 |
|
四環素抗生素，廣譜的金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑；能改變 Tet 蛋白的構像,誘導 shRNA 的表達。 |
|
Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8試劑盒或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應用于細胞活性和細胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。 |
MCE 的所有產品僅用作科學研究，我們不為任何個人用途提供產品和服務
縮寫：
PDX: Patient derived tumor xenograft
RTK: Receptor tyrosine kinase
MAPK: Mitogen-activated protein kinase參考文獻
↓ 下滑查看更多文獻
1. EusebioManchado, et al. A combinatorial strategy for treating KRAS-mutant lung cancer. Nature. 2016 Jun 30;534(7609):647-51.2. Hidenori Kitai, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition defines feedback activation of receptor tyrosine kinase signaling induced by MEK inhibition in KRAS mutant lung cancer. Cancer Discov. 2016 Jul; 6(7): 754–769.
