3類陰性對照對確定細胞的非特異性熒光的差異

實驗方案設計的第一步就是設置對照組，如何保證實驗操作的可行性以及實驗結果的可靠性，設置合理的對照組是關鍵。特別是陰性對照，不同的實驗類型陰性對照都包括好幾種，分分鐘讓你暈頭轉向，今天我們就來說說流式實驗的陰性對照。

 

 

我們都知道流式實驗是利用流式細胞儀激發細胞上結合的熒光素發射熒光，進一步通過對熒光信號的分析就可以間接反映樣品細胞的物理化學特征。但是產生的熒光都是靶標特異性的嗎？當然不是。發射熒光不僅熒光素能夠在激光的激發下產生熒光，細胞表面的某些分子或者結構也能夠產生類光，這種熒光相對于熒光素產生的熒光較弱，而且與細胞表面的特異抗原分子沒有相關性，被稱為非特異性熒光。在特定的激光激發下，細胞表面不結合流式熒光素時也會產生熒光信號。

 

通常地，每一種細胞都會產生非特異性熒光，流式檢測時得到的熒光信號是細胞本身的非特異性熒光和來自于細胞表面結合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結果。所以分析流式結果時，不能因為得到了熒光信號就判斷細胞表面肯定結合有相應的熒光素，從而得出細胞表達相應的抗原分子的結論，而應該比較該熒光信號與細胞的非特異性熒光，如果得到的熒光信號大于非特異性熒光，說明得到的熒光信號部分來源于熒光素的特異性熒光，就可以得出細胞表達相應的抗原分子的結論。

 

所以，確定與熒光素無關的細胞自身的非特異性類光的強弱非常重要，而設立陰性對照就是為了確定細胞的非特異性熒光。

 

 

話不多說，看圖，如上圖這3類陰性對照是流式分析比較全面的陰性對照：

 

第1類“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯抗體時得到的熒光信號，因為沒有標記任何類光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素無關，與細胞抗原分子CD69是否表達無關，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號；

 

第2類“抗CD69”表示的是用抗CD69抗體標記樣品細胞后得到的類光信號，雖然抗CD69抗體能修與細胞表面的CD69抗原分子結合，但是抗CD9抗體沒有偶聯熒光素，所以得到的熒光信號也與細胞表面是否表達有CD69分子無關，得到的熒光信號代表的也只是細胞本身的非特異性熒光信號，這種對照用于排除抗體的干擾；

 

第3類“IgG1-PE”表示的是標記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體IgG1類的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯的同型（isotype）對照抗體（IgG1-PE）后，得到的熒光信號，這種就屬于同型對照，其不能與細胞表面的CD69發生特異性結合，所以細胞表面不會結合有IgG1-PE，最后得到的熒光信號是代表細胞本身的非特異性熒光，不屬于PE熒光素產生的特異性熒光信號，這種同型對照用于排除熒光素的干擾。

 

以上3種陰性對照，并不用全部設置齊全，一般只需要設置1種陰性對照就可以，其中第3種同型對照是最常規的陰性對照設置法。

 

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