Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統在檢測單拷貝DNA的應用

介紹：

Azure Cielo™ 3和Cielo™ 6 實時熒光定量PCR系統具有卓越的靈敏度。該系統配置新型的高性能光學系統，采用16組光纖單孔掃描設計，一根光纖用于高能LED激發，另一根用于光信號檢測，可16孔同時采集(圖1)。特殊的激發/發射方式保證單孔掃描時僅激發一個孔，光纖傳導也有效消除光散射，完全避免孔外區域的激發，減少背景噪聲的來源，以便更靈敏的檢測。

同時Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統采用“全孔檢測”技術，每個孔可采集大約100,000個數據點。檢測時取讀數的平均值，精準測定每個孔的熒光強度。這種“全孔檢測”為每個采集時間點提供了比單孔掃描系統更準確的數據，因為單孔掃描系統僅僅采集少量的數據點。

如何可靠地檢測低拷貝數的靶標呢？首先要考慮引物和探針的特異性，這會直接影響qPCR檢測能力的高低，其次考慮靈敏度，即當探針信號高于背景噪聲時儀器檢測的靈敏度。在其他的反應成分相同的情況下，更高靈敏度的儀器可以更早的檢測到信號或得到更小的Cq值。為了證明Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統在低拷貝數的靶標檢測中的靈敏度和重復性，進行了單拷貝靶標DNA的擴增實驗。

方法：

配制20µl反應體系，利用單拷貝DNA為模板進行qPCR擴增。

分別在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統和競爭產品的系統上運行兩次96孔板。使用每個儀器提供的軟件收集和分析數據，以確定每個孔的Cq值。

結果與討論：

單拷貝DNA擴增結果發現，在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統中檢測到88個孔(92%)有熒光信號，競爭產品中檢測到77個孔(80%)(圖2A)，結果表明，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統提高了單拷貝擴增的檢測概率，這也反映了其檢測靈敏度更高。那么對于單拷貝DNA擴增來說，那些沒有熒光信號的孔可能是靶標DNA沒有進入到孔中，所以沒有檢測到熒光信號。

同時發現，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統測量的Cq平均值比競爭產品要早2個循環(Cq 36.39 vs 38.53)(圖2A)。并且Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的Cq值SD小于競爭產品的值(0.91 vs 1.16)，這進一步說明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的檢測具有良好的重復性。

此外，將兩者的擴增曲線進行比較，發現在競爭產品上某些擴增曲線起峰較晚，擴增曲線起峰位置不一致（圖3B），Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的擴增曲線起峰位置基本一致（圖3A）。這也說明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統高靈敏度的“全孔檢測”技術和多數據點的捕獲方式可以給您帶來真實可靠的擴增結果。

總的來說，隨著靶標DNA數量的減少，qPCR的可靠性也會逐漸降低，然而現代應用不斷突破這一技術的極限，對qPCR的性能提出了更高的要求。以上結果證明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統具有卓越的靈敏度和可靠性，即使檢測單拷貝DNA分子，仍可獲得具有高度重復性的定量數據。

參考文獻：

1. Lockey C, Otto E, Long Z. Real-Time Fluorescence Detection of a Single DNA Molecule. BioTechniques. 1998; 24:744–746.

2. Stowers CC, Haselton FR, Boczko EM. An Analysis of Quantitative PCR Reliability Through Replicates Using the Ct Method. J Biomed Sci Eng. 2010;3(5):459-469.

3. Stadler J, Eder J, Pratscher B, et al. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation-Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015;10(11):e0142273.

4. Tosiano MA, Jacobs JL, Shutt KA, et al. A Simpler and More Sensitive Single-Copy HIV-1 RNA Assay for Quantification of Persistent HIV-1 Viremia in Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. J Clin Microbiol. 2019;57(3):e01714-e01718.