強大的基因組編輯工具-Crisp/cas9

 關于Crisp/cas9，這個是目前研究的一個大熱門，相關的文章和技術解析層出不窮，大家對什么是Crisp/cas9應該也有了一定的了解，今天就跟大家簡單的介紹一下相關的產品吧。不過首先，我們還是再過一遍Crisp/cas9的相關概念吧。
 

 

一、 相關概念

 

（1）CRISPR/Cas是什么？CRISPR是細菌中成簇存在的具有規律間隔的短回文重復序列，是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。cas 的全稱是CRISPR associated protein，它是一種通過crRNA引導的DNA內切酶，如果DNA底物與引導RNA互補，Cas就會裂解入侵的外源DNA。

 

（2）CRISPR和Cas9共同組成了一套系統 ，CRISPR識別外源入侵的DNA，cas9負責剪切。是細菌或者古細菌的天然防御系統。而現今，被人類利用進行基因組編輯、轉錄擾亂、基因敲除、表觀遺傳調控等。

 

（3）CRISPR-Cas系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。多個科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活樣效應核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比較，CRISPR-Cas系統介導的基因組靶向實驗在細胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。

 

 

圖1來源https://www.jianshu.com/p/1e7bff7d5830

 

二 、作用機理

 

II型CRISPR系統中，CRISPR RNA（crRNA）與轉錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的復合物能特異識別基因組序列，引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。 這個識別復合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進行簡化。基因組的靶序列中有長約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補配對；靶序列末端的三核苷酸區域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識別位點，是實現剪切功能的關鍵。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的gRNA (guide RNA) 足以引導Cas9 對DNA的定點切割。

 

 

圖2 CRISPR/Cas9介導的基因組編輯原理圖

 

通過介紹，我們了解了Crisp/cas9發揮切割作用的是cas9，起識別作用的是融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA。因此，要想做好Crisp/cas9這個實驗，我們必須要準備的試劑必須涉及sgRNA和cas9蛋白兩大方面。

 

三、 產品推薦

 

針對sgRNA和cas9，我們有如下產品可供選擇哦：

 

1.sgRNA系列。

 

（1）sgRNA載體類型

 

貨號	載體	啟動子	sgRNA	是否含有Cas9核酸酶基因	篩選標記/報告基因
SG001	pCRISPR-SG01	U6	1 或多個	無，Cas9克隆單獨出售	Hygromycin
SG002	pCRISPR-LvSG03	U6	1 或多個	無，Cas9克隆單獨出售	Puromycin / mCherry
SG012	pCRISPR-CG02	U6	1	有，載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因	N/A
SG013	pCRISPR-CG04	U6	1或多個	有，載體含有CMV啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因	Neomycin / copGFP
SG014	pCRISPR-CG07	U6	1	有，載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因	copGFP
SG015	pCRISPR-CG08	U6	1	有，載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因	mCherry
—	pCRISPR-CG12	U6	1或多個	有，載體含有CMV啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因	Neomycin / mCherry

 

*配合單獨表達Cas9 核酸酶(Cat.No.  CP-C9NU-01,  CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08,  CP-LvC9NU-09,  CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01,  CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。

 

還有有上述貨號對應搭配使用的sgRNA亂序對照哦

 

貨號	產品	篩選標記	報告基因
CCPCTR01-CG02	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02.	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02.	N/A
CCPCTR01-CG04	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04
CCPCTR01-CG07	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07
CCPCTR01-CG08	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry
CCPCTR01-LvSG03	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03	mCherry
CCPCTR01-SG01	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01	N/A

 

（2）還有sgRNA亂序對照慢病毒顆粒

 

貨號	產品	描述	啟動子	篩選標記	sgRNA
LPP-CCPCTR01-LvSG03-100	sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（25 µL×4管）	108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉導級	EF1a	Puromycin	CCPCTR01-LvSG03
LPP-CCPCTR01-LvSG03-400	sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（100µL，25 µL×16管）	108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉導級	EF1a	Puromycin	CCPCTR01-LvSG03

 

圖3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設計；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對照克隆（泳道2）轉染HEK293T細胞。轉染40h后收集細胞，提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進行PCR擴增，凝膠純化PCR產物，將純化后的產物與緩沖液混勻，經變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經PCR后的產物片段長度應為520bp，T7 ENI剪切后的產物應分別為330bp和190bp。

 

圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個基因。實驗組（1-4泳道）為Cas9表達克隆及分別表達靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。對照組（5-8泳道）為Cas9表達克隆質及隨機sgRNA表達克隆的質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。通過T7核酸內切酶檢測分析基因組DNA各個靶點上同時存在的插入缺失。*號標記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個靶點的sgRNA都在目標靶點上有效地誘發了插入缺失突變（1-4道）。PCR產物條帶及T7核酸內切酶酶切產物條帶大小：GFP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).

 

（3）sgRNA 文庫

 

 

圖5. A：混合文庫篩選。對感染了sgRNA混合文庫的細胞株進行篩選，獲取具備目的表型的陽性細胞株進行Sanger測序識別對應的sgRNA，或通過深度測序搜索比例過高或過低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文庫array（獨立克隆文庫）進行基因敲除篩選。各板孔里的細胞株分別感染不同的sgRNA慢病毒顆粒，并篩選具備目的表型的陽性細胞株。如此無需測序即可獲知與目的表型相關的sgRNA。

 

人類 sgRNA 文庫相關產品

 

貨號	文庫	sgRNA 數目	基因數目	管數	載體
L01-LS03	Innate kinases & ubiquitin ligases	475	239	4 管，每管 118-119 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L02-LS03	Nuclear hormone receptors	236	118	2 管，每管118 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L03-LS03	Tumor metastasis genes	114	57	2 管，每管 57 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L04-LS03	Oncogenes	576	288	4 管，每管 144 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L05-LS03	Tumor suppressor genes	462	231	4 管，每管 115-116 個 sgRNA	pCRISPR-LvSG03
L06-LS03	Protein kinases	1316	658	10 管，每管 130-131 個 sgRNAs	pCRISPR-LvSG03
L07-LS03	Key genes in 50 pathways	278	139	2 管，每管 139 個sgRNA	pCRISPR-LvSG03

 

2.Cas9系列產品

 

（1）Cas9表達克隆產品

 

貨號	產品	啟動子	報告基因
Cas9核酸酶表達克隆
CP-C9NU-01	Cas9核酸酶表達克隆	CMV	mCherry / Neomycin
Cas9核酸酶慢病毒表達克隆
CP-LvC9NU-01	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	CMV	Neomycin
CP-LvC9NU-02	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	CMV	eGFP / Neomycin
CP-LvC9NU-08	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	EF1a	Puromycin
CP-LvC9NU-09	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	EF1a	eGFP / Neomycin
CP-LvC9NU-10	Cas9核酸酶慢病毒表達克隆	EF1a	eGFP / Hygromycin
Cas9 D10A 切口酶表達克隆
CP-C9NI-01	Cas9 D10A 切口酶表達克隆	CBh	N / A
CP-C9NI-02	Cas9 D10A 切口酶表達克隆	CMV	mCherry / Neomycin

 

（2）慢病毒顆粒類產品

 

貨號	產品	描述	啟動子	報告基因
LPP-CP-LvC9NU-01-100	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉導級，100 µL.	CMV	Neomycin
LPP-CP-LvC9NU-02-100	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	1×10^6 – 1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉導級，100 µL.	CMV	eGFP/Neomycin
LPP-CP-LvC9NU-10-400	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉導級，400 µL.	EF1α	eGFP/Hygromycin
LPP-CP-LvC9NU-08-100	Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒	不低于1×10^7 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒，轉導級，100 µL.	EF1α	Puromycin

 

（3）GeneHero™ Cas9 穩定表達細胞系

 

新貨號	產品	細胞系	Cas9 整合位點	產品規格
SL501	穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 H1299 單克隆細胞系	H1299	AAVS1	1管，每管細胞數2×106
SL502	穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T 單克隆細胞系	HEK293T	AAVS1	1管，每管細胞數2×106
SL503	穩定表達 Cas9 核酸酶基因的 人類 HeLa 單克隆細胞系	HeLa	AAVS1	1管，每管細胞數2×106
SL520	穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類AGS單克隆細胞系	AGS	隨機整合	1管，每管細胞數2×106
SL522	穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類SNU475單克隆細胞系	SNU475	隨機整合	1管，每管細胞數2×106

 

(4）GeneHero™ Cas9蛋白類產品

 

貨號	規格	產品
GE001	25μg	重組Cas9蛋白含NLS
GE002	100μg	重組Cas9蛋白含NLS
GE003	25μg	重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag
GE004	100μg	重組Cas9蛋白含NLS和C-terminal 6x His-tag

 

 

圖6. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。針對HUWE基因設計3個sgRNA，分別與Cas9蛋白孵育后進行下一步切割實驗。紅點標注為切割后的DNA條帶，Ct為未切割的HUWE DNA片段

 

 

圖7. 使用HUWE DNA片段作為切割模板。sgRNA與Cas9蛋白孵育后進行切割實驗。GeneHero™ Cas9蛋白（3-5列）與IDT Alt-R® Cas9蛋白（6-7列）分別進行250ng，100ng和50ng稀釋反應。紅箭頭標注為切割后的DNA條帶，1列反應中只有Cas9，2列反應中只有sgRNA。

 

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