如何提高PCR的擴增特異性

      疫情當下，最熱頻的詞匯莫過于核酸檢測了。而核酸檢測最核心的技術(shù)也越來越被大眾所熟知，就是我們高中就學過的聚合酶鏈式反應(yīng)，又稱為PCR。

 

       自從1983年，Kary Mullis才發(fā)明出這個用于擴增目標DNA的研究工具—PCR技術(shù)后，其逐漸成為分子生物學研究必不可少的一部分，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。而Kary Mullis也因這一發(fā)明獲得了1993年的諾貝爾化學獎。

 

       而熟悉PCR的同學們都知道，PCR之所以能夠在短時間內(nèi)將單個DNA分子擴增數(shù)百萬倍以便于下游實驗檢測，主要依靠這三個步驟連續(xù)多次循環(huán)而實現(xiàn)：

 

      （1） DNA變性：首先對雙鏈DNA模板進行高溫加熱，使DNA雙鏈變性解離成單鏈；

 

      （2） 引物退火：被稱為引物的短DNA分子與目標DNA的側(cè)翼區(qū)域結(jié)合；

 

      （3） 延伸擴增：DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進行延伸。將這些步驟重復(fù)（“循環(huán)”）25-35次，即可按指數(shù)方式獲得精確的目標DNA拷貝。

 

 

       而PCR這項核心技術(shù)的核心是強大的DNA聚合酶，其在新DNA鏈合成中扮演著重要的角色，是PCR反應(yīng)不可或缺的組成部分，是保證PCR擴增產(chǎn)物特異性、熱穩(wěn)定性、保真度等方便的重要因素。

 

       而對目的基因進行PCR擴增的過程中，延伸錯配的非特異產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生是PCR實驗中常遇到的問題，這些都與DNA聚合酶有關(guān)。因為這種非特異擴增會顯著降低目的基因擴增的產(chǎn)率和靈敏度，從而影響擴增結(jié)果的合理解釋和下游實驗應(yīng)用的成功。

 

       那么，問題來了，如何減少非特異性擴增？

 

       方案之一：在冰上配制PCR反應(yīng)，這是我們經(jīng)常的操作。因為這樣有助于將DNA聚合酶的活性保持在低水平。

 

       但在PCR開始之前，依然可能會合成不需要的產(chǎn)物。

 

       另一個辦法是將DNA聚合酶的加入時間推遲到第一個循環(huán)的退火步驟。因為只有在90℃以上的初始變性步驟之后才能開始擴增，所以該技術(shù)被稱為“熱啟動”。所以后來為了避免非特異性擴增，科學家們開始進行手動熱啟動PCR反應(yīng)，但是這個過程不僅費時費力，而且會增加樣品污染和降低實驗可重復(fù)性的風險。
 

       后來，人們發(fā)明了具有熱啟動特性的DNA聚合酶，既抗體修飾的DNA聚合酶。

 

       這種DNA聚合酶通過對酶活性位點抗體修飾，抑制其在室溫下的活性，在初始高溫變性步驟（如，>90℃）階段，結(jié)合的抗體失活，從而激活DNA聚合酶。

 

    

 

       由于DNA聚合酶在室溫下的活性被抑制，所以，熱啟動技術(shù)為在室溫下配制多個PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利，且不會影響特異性和擴增能力

 

       而BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列PCR試劑盒既是基于抗體修飾法的qPCR定量檢測試劑盒。

 

       BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列試劑盒采用了新型抗體修飾的BlazeTaq™熱啟動DNA聚合酶，室溫時酶的活性被抗體完全封閉，更有效地抑制非特異性擴增；反應(yīng)時只需95°C預(yù)變性30 s即可使酶完全被激活，可明顯地縮短qPCR反應(yīng)時間。此外，優(yōu)化的Buffer體系顯著提高Real Time PCR反應(yīng)的靈敏度和重復(fù)性，同時具有擴增效率高、特異性強、檢測范圍廣的特點，并能有效抑制引物二聚體的產(chǎn)生，使實驗結(jié)果更加可靠。

 

       本產(chǎn)品提供了一種通用的反應(yīng)條件及實驗操作流程，且推出帶有、或不帶有ROX參比染料的兩個版本供用戶選擇，適用于大多數(shù)熒光定量 PCR 儀。

 

       產(chǎn)品優(yōu)勢

 

       靈敏度高：可檢測低至5個拷貝數(shù)的DNA模板

       特異性強：抗體修飾熱啟動DNA聚合酶，更有效抑制引物二聚體以及非特異性擴增的產(chǎn)生

       擴增效率高：在寬廣的GC含量范圍內(nèi)能維持高擴增效率

       操作簡單：預(yù)先配好的5×預(yù)混液，反應(yīng)前只需加入模板、引物、滅菌水

       適用性廣：提供帶有或不帶有ROX的兩個版本可選，適用于大多數(shù)熒光定量PCR儀

 

   

     
        圖1. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0擴增8個10倍梯度稀釋的雙鏈DNA片段，DNA拷貝數(shù)范圍為5×107~5個拷貝。如圖所示，試劑盒顯示出高靈敏度的特性，在寬廣的定量范圍內(nèi)具有優(yōu)異的線性相關(guān)性。

競品產(chǎn)品性能對比：

 

 

 

       圖3. BlazeTaq™（紅色）與Powerup™ SYBR Green Master Mix（綠色）和Promega（藍色）GoTaq® QPCR Master Mix（綠色）的性能對比顯示，其靈敏度、擴增效率和特異性更高。

 

 

       圖4. Ct值比較。 使用BlazeTaq™（藍色），Applied Biosystems的PowerUp™ SYBR Green Master Mix（橙色）和來自Promega的GoTaq® qPCR Master Mix（灰色）擴增來自10 ng HeLa cDNA的41個基因。

 

 

       圖5.使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分別擴增50個和5個拷貝數(shù)的同一個DNA模板，并設(shè)無模板對照（NTC組），每組qPCR反應(yīng)重復(fù)24次。結(jié)果顯示，試劑盒對低濃度模板的擴增實驗重復(fù)性好。cDNA的41個基因。

 

BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0擴增

 

圖6. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分別擴增不同GC含量（GC含量范圍在39.3~61.2%之間）的DNA模板。結(jié)果顯示，各模板的擴增效率仍能維持在90%~110%之間，表明試劑盒對GC含量在一定范圍內(nèi)的DNA模板適用性廣。

 

產(chǎn)品名稱	描述	貨號	規(guī)格
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0	新型real-time PCR專用試劑，包含已優(yōu)化濃度的抗體修飾Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP、Mg2+和SYBR Green的混合試劑，以及ROX參比染料	QP031	20ul體系×200次qPCR反應(yīng)
		QP032	20ul體系×600次qPCR反應(yīng)
		QP033	20ul體系×1200次qPCR反應(yīng)
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0 (without ROX)	新型real-time PCR專用試劑，包含已優(yōu)化濃度的抗體修飾Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP、Mg2+和SYBR Green的混合試劑	QP041	20ul體系×200次qPCR反應(yīng)
		QP042	20ul體系×600次qPCR反應(yīng)
		QP043	20ul體系×1200次qPCR反應(yīng)

 

       艾美捷科技有限公司，通過提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價值觀：“激情、敬業(yè)、學習、創(chuàng)新、合作、卓越”。激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競爭力的生物醫(yī)學產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造最大價值是我們的企業(yè)使命。我們的企業(yè)愿景是成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。

 

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