多酶恒溫核酸快速擴增技術MIRPA的引物與探針設計指導

近期,頂級學術期刊連發兩篇頂級論文，上半年引爆生物圈的華人科學家張鋒教授團隊又有新動作!這次,他在一月內,分別在《Nature》、《Science》連發兩篇論文!他將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級(aM,10的負18次方摩爾每升),可以檢測單分子的SHERLOCK技術。而這其中,RPA起到了不小的作用。

RPA,即重組酶聚合酶擴增技術,是在由多種酶和蛋白的參與下,在恒溫條件下實現核酸指數擴增的技術,被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。是英國TwistDx公司開發的，該公司通過突破等溫DNA擴增，開發的重組酶聚合酶擴增專利技術（RPA），被譽為DNA診斷領域的革命性創新。

安普未來生物科技有限公司經過十年技術沉淀，以代表未來技術趨勢的多酶恒溫快速擴增技術，MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）。

MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）技術是一種多酶恒溫核酸快速擴增技術，

基本原理是：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體 Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白 SSB 的幫助下，侵入雙鏈 DNA 模板；在侵入位點形成 D-loop 區域，并開始對 DNA 雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體 Rec/ssDNA 解體的同時，聚合酶也結合到引物的 3’末端，開始鏈的延伸，這個過程迅速高效地循環，從而完成目的片段超快速擴增。

熒光檢測則依賴核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備實現對目標片段擴增過程的實時監控。
 
★引物設計

建議使用長度在 30-35bp 的引物，引物過長或過短會影響擴增速度和檢測靈敏度（特殊情況下設計較長

引物比較困難的序列，引物長度可縮短至 25 bp，但最好不少于 25 bp）；引物序列要求：
1.堿基排布隨機性高，GC 含量在 30%-70%之間；
2.擴增片段避免形成二級結構而影響擴增；
3.擴增片段長度建議在 150-300 bp，通常不超過 500 bp。

★熒光探針設計

在上下游引物中間，設計一段長度為 46-52nt 與目的片段互補的序列作為熒光探針；探針序列不與特異
性引物識別位點重疊，長度為 46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四

個修飾位點：
1.距離 5’端的 30-35 nt 的中部位置標記一個 dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點 （任
何堿基，無特殊要求） ；
2.THF 位點的上游的 T 堿基上標記一個熒光基團（如 FAM），下游在 T 堿基上標記一個淬滅基團（如
BHQ1），兩個基團的間距為 2-4 nt；
3.THF 距離 3’末端約 15 nt，并且 3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或 C3-spacer。
4.探針示例：
探針序列：
5’-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’
                30-35nt                                ≥15nt

探針修飾：
ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM-dT]AG[THF][BHQ-dT]CTCAAAGATGGACC-3’C3spacer。
 http://www.warbio.cn/news/show-1388.htm