DAP-seq技術(shù)助力胡楊耐鹽機(jī)制的研究

       2019年9月，北京林業(yè)大學(xué)和藍(lán)景科信合作，在植物學(xué)主流學(xué)術(shù)期刊Journal of Experimental Botany上（IF=5.36），發(fā)表了題為“Populus euphratica WRKY1 binds the promoter of H⁺-ATPase gene to enhance gene expression and salt tolerance”的研究成果。該研究借助DNA親和純化測(cè)序技術(shù)（DNA Affinity Purification Sequencing， DAP-seq），深入揭示了胡楊耐鹽的分子機(jī)制。

       胡楊（Populus euphratica Oliv.）是西北鹽堿荒漠地區(qū)，唯一可以形成森林的高大喬木，是研究木本植物耐鹽分子和生理機(jī)制的模式樹種。但是胡楊的基因組相對(duì)復(fù)雜，高度雜合；而且，胡楊不容易建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究難度大，亟需使用創(chuàng)新技術(shù)研究胡楊耐鹽的分子機(jī)制。
       胡楊的耐鹽性高于其它種類的楊樹，鹽脅迫下，胡楊將Na⁺和Cl^－區(qū)隔化到細(xì)胞的液泡中，限制NaCl向木質(zhì)部導(dǎo)管的裝載。胡楊能促進(jìn)Na⁺的外排、減少K⁺流失，維持離子平衡以降低鹽害。胡楊在長(zhǎng)期鹽脅迫下，能夠保持質(zhì)膜H⁺-ATPase的活性，從而具有較強(qiáng)的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力。然而，胡楊質(zhì)膜H⁺-ATPase的轉(zhuǎn)錄與酶活調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。本研究借助DAP-seq技術(shù)，深入研究了PeWRKY1通過調(diào)控質(zhì)膜H⁺-ATPase PeHA1的表達(dá)，參與胡楊耐鹽性形成的過程。

圖1. 使用DAP-seq技術(shù)獲得PeWRKY1結(jié)合的motif。


圖2. 使用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子的互作。


圖3. 使用凝膠阻滯技術(shù)（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）驗(yàn)證PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子中W-box的相互作用。

圖4. 使用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子的互作。

研究結(jié)論

       本研究使用DAP-seq技術(shù)，在基因組水平上，鑒定了PeWRKY1轉(zhuǎn)錄因子與胡楊基因組DNA的結(jié)合位點(diǎn)信息。并通過酵母單雜交、EMSA、熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證了這一結(jié)果。鹽脅迫促進(jìn)了PeWRKY1與PeHA1啟動(dòng)子區(qū)W-box的結(jié)合，從而提高了PeHA1的表達(dá)。PeWRKY1與PeHA1的相互作用，有助于增加質(zhì)膜H⁺-ATPase的活性、促進(jìn)Na^＋的排出，使胡楊在鹽脅迫下保持離子平衡。
 

       在基因組水平上，鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding sites, TFBS）非常重要。ChIP-seq是進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)TFBS的主要方法。然而，ChIP-seq依賴于抗體質(zhì)量，這對(duì)低表達(dá)的蛋白質(zhì)具有很大的挑戰(zhàn)性。所以，ChIP-seq通常在規(guī)模上受到限制，難以進(jìn)行高通量擴(kuò)展。因此，只有少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子可以獲得結(jié)合位點(diǎn)信息，大量TFBS的覆蓋范圍僅適用于人類和一些模式生物。

       DAP-seq具有與ChIP-seq同樣的功能。通過體外蛋白表達(dá)技術(shù)，表達(dá)出帶有標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄因子，和基因組DNA文庫在體外進(jìn)行結(jié)合，然后分離出所有與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA，再使用高通量測(cè)序，找到轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。

DAP-seq的優(yōu)勢(shì)
       與ChIP-seq相比，DAP-seq不需要針對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子制備特異性抗體。具有快速、高通量、節(jié)約時(shí)間成本的優(yōu)勢(shì)，并且適用于所有的真核生物。
 
       藍(lán)景科信提供DAP-seq全流程技術(shù)服務(wù)+個(gè)性化數(shù)據(jù)分析，與中國科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國林業(yè)科學(xué)研究院、浙江大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、北京林業(yè)大學(xué)、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)等多個(gè)科研院所合作，具有豐富的技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)。已經(jīng)做過的材料包括：擬南芥，水稻，小麥，玉米，大豆，苜蓿，百脈根，菜心，棗，荔枝，香蕉，毛果楊，胡楊，油松。