如何解決臺盼藍染色PBMCs進行細胞計數的問題

   “為什么很難用臺盼藍染色劑來計數PBMC！有大的，小的，成團的……；你能告訴我怎么在未染色的細胞中挑出有核細胞？”小編經常被問到各種各樣關于如何計數PBMC的問題，今天就借此機會跟大家分享一下。
 
首先，了解下人類PBMCs的組成

      外周血單核細胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC),大部分都是淋巴細胞，包括B細胞和T細胞，其中CD3 T細胞又占了淋巴細胞中絕大部分(45-70%)。相對于淋巴細胞，單核細胞的比例在10-30%，受到刺激之后會發育成樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞。干細胞的比例非常低，只有0.1-0.2%。紅細胞和血小板沒有核，主要負責運送氧。
 

 

傳統計數PBMCs的方法

     原代細胞，對于傳統的計數方法，絕對是一種挑戰！原代細胞懸液中包含各種異質性的細胞類型和在消化過程中產生的細胞碎片。而且，因為樣品采集的部位不同，來源的病人不同，以及分離過程中的差異，樣品往往千差萬別。PBMC研究要求精確地判斷細胞死活，數量等等，對于進行后續的實驗非常重要。
 
     在傳統的血球計數板+顯微鏡模式下，很難把PBMC細胞和紅細胞分開來。PBMC細胞在光鏡下，和腫瘤細胞相比很小，紅細胞兩面凹的形態，只能通過經驗和更加靈敏清晰的顯微鏡進行人為識別。因此引入太多的人為因素，而導致誤差極大，也會使操作者疲憊不堪。

      因此有研究人員嘗試用臺盼藍進行PBMC的死活的鑒定。臺盼藍是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染色方法之一。活細胞不會被染成藍色，而死細胞會被染成淡藍色。    PBMC分離過程中，會有紅細胞的殘留，雖然紅細胞沒有核，但是大小與PBMC接近；因為胞膜完整，所以紅細胞也不會被染成藍色，因此傳統臺盼藍方法不能分辨紅細胞與活的PBMC，紅細胞也將被誤認為是PBMC細胞，影響PBMC的活率和活細胞總數。

另外，PBMC實驗還有其自身的特點：1. 隨著時間的延長，細胞質量下降；2. 許多單細胞測序的相關實驗，需要快速準確計數細胞死活和判斷細胞結團情況，決定樣本是否適合上機檢測。所以，快速計數，并得到準確的結果是保證后續實驗順利進行的關鍵。
 
精準的熒光計數法

      公認標準的熒光細胞計數法采用AO/PI染料雙染細胞核來檢測細胞的狀態。AO/PI試劑由可以發出綠色熒光的DNA結合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡稱AO）和可以發出紅色熒光的DNA結合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡稱PI）組成。其中AO可以通過完整的細胞膜，嵌入所有細胞（活細胞和死細胞）的細胞核，呈現綠色熒光；PI只能通過不完整的細胞膜，即死細胞的細胞膜，嵌入所有死細胞的細胞核，呈現紅色熒光。

      當兩種染料均存在于細胞核內，在合適的AO、PI配比下，兩種染料發生能量共振轉移，死細胞在綠色通道下激發出紅色熒光。由于AO和PI為DNA結合染料，因此可有效排除雜質以及紅細胞的干擾，確保對樣品進行準確計數。
 

 

上圖為我們使用美國DeNovix公司的CellDrop FL 熒光細胞計數儀采用AO/PI染料，10秒內即可完成對PBMCs的準確計數。

建議

      所以，就不要再用明場或是借助臺盼藍進行PBMCs細胞死活計數了。用AO/PI染料結合熒光計數儀，才是PBMCs精確計數和活力分析的金標準。