免疫印跡Western bloting實驗原理

免疫印跡Western bloting
    這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體（NC、PVDF膜），并以特異性抗體作為探針檢測之。抗體與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行定性、分析。

材料（MATERIALS）
o  試劑（REAGENTS）
1.0 M Tris-Hcl（PH6.8）
1.5 M Tris-HCl（PH8.8） 
10% AP（不要配太多）
10% SDS
30% Acr
20% Tween20
10 mM PMSF
0.2 M NaH2PO4
0.2 M Na2HPO4
TBST
轉移膜
化學發光試劑
轉移緩沖液（TB buffer）
電泳緩沖液（EB buffer）
PBS緩沖液
10×麗春紅染液
封閉液（5% 脫脂牛奶）
濾紙
SDS 上樣緩沖液
o  實驗前準備
裂解液中加入終濃度為1 mM的PMSF，離心機預冷，PBS預冷，TB buffer 4℃預冷，
o  器械（EQUIPMENT）
垂直板電泳轉移裝置、高速離心機、分光光度計、脫色搖床、搪瓷盤、蛋白電泳裝置、勻漿器
實驗步驟（PROCEDURE）
蛋白樣品制備 預計時長：1h

(一)  貼壁細胞總蛋白的提取：
1.   按1 ml裂解液加10μl PMSF（100 mM）混勻后置于冰上。
2.   吸去細胞培養基，用4℃預冷的PBS洗兩次后，根據細胞數目加入相應體積的裂解液搖勻于冰上裂解30 min（60 mm皿加1 ml）期間可搖動混勻。
3.   裂解完成后，用槍頭將細胞刮掉然后轉移到1.5 ml EP管中。
4.   2-3步也可為：加入裂解液靜置兩分鐘后刮下細胞，轉移到1.5 ml EP管中，用超聲破碎細胞。
5.   12000 g × 5 min 4℃離心后，轉移至新的EP管中。
6.   -20℃保存或進行下一步。

(二)  懸浮細胞總蛋白的提取
1.      將培養基倒至15 ml離心管中，800 g × 5 min 4℃離心，吸出培養基，加入2 ml 4℃預冷PBS重懸細胞后再次800 g × 10 min 4℃離心，盡量吸干PBS，加入裂解液冰上裂解30min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。 
2.      將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起12000 g × 5 min 4℃離心，取上清于1.5 ml離心管中并置于－20℃保存或進行下一步。

(三)  組織中總蛋白的提取
1.      將組織塊盡量剪碎，加入含PMSF的裂解液于勻漿器中，進行勻漿然后置于冰上。
2.      幾分鐘后，再次勻漿，置于冰上。如此反復幾次使組織盡量碾碎。
3.      裂解30 min后，將裂解液移至1.5 ml EP管 中，12000 g × 5 min 4℃離心，取上清于1.5 ml離心管中并置于－20℃保存或進行下一步。
蛋白質定量
一般選擇BCA或者Bradford方法，具體方法見各試劑盒說明書。BCA要求檢測波長為562 nm，Bradford為595 nm。為避免假陽性結果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬斯G250混合看是否產生顏色。具體測完蛋白含量后，計算含50-100 ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個泳道最大能承載的蛋白質量為150ug）。

(一)  制作標準曲線
1.      從-20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
2.      取18個1.5 ml離心管，3個一組，分別標記為0 μg，2.5 μg，5.0 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0 μg。
3.      按下表在各管中加入各種試劑。

	0 μg	2.5 μg	5 μg	10 μg	20 μg	40 μg
1 mg/ml BSA		2.5μl	5μl	10μl	20μl	40μl
0.15 M NaCl	100μl	97.5μl	95μl	90μl	80μl	60μl
G250 溶液	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml

4.      混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計上比色分析。

(二)  檢測樣品蛋白含量
1.   取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。
2.   取一管考馬斯亮藍加0.15 M NaCl 100μl，混勻放置2 min 可作為空白樣品，將空白倒入比色皿中做好的標準曲線程序下按Blank測空白樣品。
3.   棄空白樣品，用無水乙醇清洗bisemin2次，用無菌水洗一次。
4.   取一管考馬斯亮藍加95 μl 0.15 M NaCl 溶液和5μl 待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min后測量。
SDS-PAGE電泳  預計時長：3.5h

（一）灌膠與上樣
1.   玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏液，然后用濾紙將水吸干）。
2.    選擇合適的分離膠濃度配置，注意最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。此外應保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。灌膠時膠要沿玻璃板流下，否則膠中易有氣泡（濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水或異丙醇，（加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。注意給濃縮膠留出足夠的空間（推薦長度為插入的梳齒長再加1cm）
3.   當水和膠之間有一條折射線時說明膠已凝了，一般需半個小時（氣溫高會快些）。倒去膠上層水或異丙醇并用吸水紙吸干或放倒靜置幾分鐘將水流干。AP不新鮮會導致聚合變慢，必要時可適當增加AP以及TEMED的量，但通常不會超過1h
4.   配制濃縮膠，方法與操作同分離膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中，避免膠與梳子之間有氣泡。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補膠至剛剛冒頂。

SDS-PAGE配方

分離膠	15%	12%	10%	8%	6%	濃縮膠	5%
ddH2O	1.76ml	2.64 ml	3.2 ml	4.6 ml	4.24 ml	ddH2O	3.4 ml
30%丙烯酰胺	4ml	3.2 ml	2.64 ml	2.6 ml	1.6 ml	30%丙烯酰胺	0.83 ml
1.5M Tris-Hcl（8.8）	2ml	2 ml	2 ml	2.6 ml	2 ml	1.0M Tris-Hcl（6.8）	0.63 ml
10% SDS	80μL	80μL	80μL	80μL	80μL	10%SDS	50μL
10% APS	80μL	80μL	80μL	80μL	80μL	10%APS	50μL
TEMED	3.2μL	3.2μL	3.2μL	3.2μL	3.2μL	TEMED	5μL

▲關鍵步驟：
1. 過硫酸銨用量很少，且易變質，一次不要配太多，最多不超過兩周。
2. 未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性，操作時應該戴手套防護。
（二）上樣、電泳
1.   測完蛋白含量后，計算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至1.5 ml離心管中，加入5 × SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品100 ℃ 5 min使蛋白變性。
2.   濃縮膠電泳電壓為110 V，當樣品在濃縮膠、分離膠交界處被壓為一條線時，電壓調為130 V
轉膜   預計時長：3h
1.   在電泳結束前20 min開始準備轉膜所需的東西。轉一張膜需準備6張的濾紙（長一般為8.1~8.3 cm，寬度根據裁的膠大小實際測量，但膠一般會縮水，所以裁8cm就行）和1張NC或PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF膜使用前用無水甲醇中浸泡1 min-2 min，NC膜不需要。目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
2.   將玻璃板撬開后，輕輕刮去濃縮膠，用蒸餾水沖洗干凈。取出凝膠后可以在右上角裁一個小角以區分上下左右。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉膜。
3.   在陶瓷盆中倒入TB buffer，放入浸過甲醇的PVDF膜平衡10 min。帶上手套，將夾子打開使黑的一面平放轉移槽的底座，依次在石墨電極上墊一張海綿墊、疊放3張浸泡過緩沖液的濾紙、剛剛完成電泳的凝膠、PVDF膜（此時可在膜右上角減去一個角，以辨明轉膜后的蛋白面與非蛋白面）、和另外3張浸泡過緩沖液的濾紙、另一個海綿墊，合起夾子。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發生短路。
4.  將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產熱，所以TB Buffer要在4℃預冷，轉移槽要放在冰水混合泡沫箱中。的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉移2 h或40 V轉移3 h。
5.  轉完后將膜用1× 麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖，可回收）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。使用預染marker話可以看見marker的顏色轉印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉印完全或轉印過頭是不可靠的。
▲關鍵步驟：操作是要戴手套，否則手上的蛋白會造成污染。
免疫雜交反應  預計時長：1 Day
1.  封閉：將膜用TBST浸濕，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h即可，注意封閉后不要洗脫，（如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質）。
2.  一抗孵育： 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以）至適當濃度（可以在5 ml EP管中配置工作液，常用稀釋倍數為1:1000，具體按抗體說明來，用后可回收重復用2-3次， -20℃保存，避免反復凍融）。

一、二抗孵育有兩種方法：
1） 膜孵：撕下適當大小的一塊兒封口膜（也可使用保鮮膜）鋪于培養皿蓋上，使封口膜保持平整，將抗體溶液加到封口膜上，從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡，放于濕盒中，室溫孵育1 h或4℃過夜孵育。用TBST在室溫下脫色搖床上洗6×5 min。
2）配制5 ml抗體稀釋液于5 ml EP管中，直接將膜放入，4℃過夜孵育，用TBST在室溫下脫色搖床上洗4×5 min。
3.      二抗孵育： 方法同一抗孵育，但一般二抗稀釋比較大1:10000足夠。用TBST在室溫下脫色搖床上洗4×5min。
化學發光  預計時長 10min
化學發光反應：在實驗臺上鋪一張一次性手套，將轉移膜放在手套上，蛋白面向上。將化學發光的A液和B液兩種試劑在EP管內等體積混合（總體積能夠覆蓋住膜就行，注意吸完A液后吸B液要換槍頭，否則整瓶試劑都將報廢），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應1-2 min后（無需避光），將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，凝膠圖象分析或X-光片曝光。
X-光片曝光：
1.  將轉移膜放在保鮮膜上，把另一側翻過來蓋在其上，把保鮮膜固定在片夾上。
2.  在暗室中，將配好的顯影液和定影液倒入塑料盆中，打開紅色照明燈，取出X光片，剪成比膜稍大，疊放3-4層后放在膜上，不要再移動X光片，關上X片夾，計時2-5 min。（多層膠片的目的是找到最合適的曝光度）
3.  時間完成后，打開片夾，X光片放入顯影液，出現明顯條帶后停止顯影，放入定影液，定影5-10 min至膠片透明。
4.  用水將膠片沖干凈，晾干，觀察結果。定影液和顯影液可回收，避光室溫放存，但不宜放太久。
▲關鍵步驟：
1.發光液的A、B液一定不能相互污染，吸取時一定要注意換槍頭。
2.發光液配制好后應立即使用。
3.暗室中光線很弱，可暗適應一段時間在開始實驗，拿膠片的時候避免用指甲滑到，會有劃痕。

附錄
相關試劑的配制：
1.    封閉液（5% 脫脂牛奶的TBST緩沖液）
脫脂奶粉              5g 
TBST                 100ml 
溶解后4℃保存。使用時，恢復室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。如不經常用，可每次現用現配所需體積。
2.    TBST緩沖液（含0.05％ Tween20的TBS緩沖液）
20％Tween20        1.65ml             
TBS                700ml              
混勻后即可使用，最好現用現配。
3.    TBS緩沖液（100 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl）   
1 M Tris-HCl（pH7.5）  10 ml
NaCl                   8.8g
蒸餾水至               1000ml
4.    10×麗春紅染液 
麗春紅S         2 g
三氯乙酸        30 g
磺基水楊酸      30 g
蒸餾水至        100 ml 
使用時將其稀釋10倍。
5.    轉移緩沖液（48 mM Tris，39 mM甘氨酸，0.037％ SDS，20％ 甲醇）
甘氨酸（MW75.07）        2.9g
Tris（MW121.14）          5.8g  
SDS                       0.37g  
甲醇                       200ml
蒸餾水至                   1000ml 
溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3～5次
6.    電泳液緩沖液（25 mM Tris，0.25 M甘氨酸，0.1％ SDS）               
Tris（MW121.14）           3.03g
甘氨酸（MW75.07）         18.77g 
SDS                        1g
蒸餾水至                    1000ml   
溶解后室溫保存，次溶液可重復使用3-5次。
7.    1.74 mg/ml (10 mM) PMSF          
PMSF          0.174 g          
異丙醇         100 ml 
溶解后，分裝于1.5 ml離心管中，－20℃保存。  
8.    10% SDS
SDS                  10 g          
蒸餾水至              100 ml 
50℃水浴下溶解，室溫保存。
如在長期保存中出現沉淀，水浴溶化后，仍可使用。  
9.    10% 過硫酸胺（AP） 
過硫酸胺             0.1 g                    
超純水               1.0 ml
溶解后，4℃保存，保存時間為1周。
10.  30% Acr/Bic                
丙稀酰胺（Acr）               29 g 
甲叉雙丙稀酰胺（Bic）         1 g
超純水至                      100 ml 
37℃下溶解后，濾膜過濾，棕色瓶4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。
11.  20% Tween20
Tween20            20 ml
蒸餾水至            100 ml
混勻后，4℃保存。
12.  0.01 M PBS(PH 7.3)
0.2 M NaH2PO4        19ml
0.2 M Na2HPO4        81ml
NaCl                  17g
蒸餾水至               2000 ml
13.  G250 考馬斯亮藍溶液（測蛋白含量專用）
G250         100 mg
95% 乙醇     50 ml
磷酸          100 ml
蒸餾水至      1000 ml
先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加水和磷酸，混勻后4℃保存。
14.  100 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
BSA            0.1g
0.15 M NaCl     1 ml
溶解后，-20℃保存。制作蛋白標準曲線時，用0.15 M NaCl 進行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存。