酵母雙雜交檢測（Yeast Two-Hybrid Assay）的原理及應用

檢測原理：
       酵母雙雜交系統（Yeast two-hybrid assay）是用于體內研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具，常用的如GAL4為基礎的系統，使用酵母轉錄因子GAL4來檢測轉錄激活后的蛋白相互作用。某些轉錄因子（如GAL4）由兩個可以分開，功能上相互獨立的結構域組成，N端有一個147個氨基酸組成的DNA結合域（DNA binding domain，BD），C端有一個由113個氨基酸組成的轉錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）結合，而AD能激活UAS下游基因進行轉錄。單獨的BD或AD不能激活基因轉錄，兩者只有通過某種方式結合在一起形成完整的轉錄激活因子的功能。酵母雙雜交系統主要利用酵母GAL4的這個特性通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來研究活細胞內蛋白質的相互作用，對蛋白質之間微弱、瞬間的作用都能通過報告基因敏感的檢測到。
酵母雙雜交系統應用：
對新的與已經蛋白相互作用的鑒定
對預測蛋白相互作用的確認
對蛋白相互作用區域的鑒定

酵母雙雜交系統重要元件介紹（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
一、誘餌（the bait）
為了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推薦使用質粒pGBKT7；
要調查三元蛋白復合物，推薦使用含2個MCS區域的三雜交載體，能表達GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二個感興趣蛋白，在bait和prey蛋白之間發揮橋梁作用。

二、檢測蛋白作用的四個報告基因
Matchmarker gold系統是采用4個報告基因/3個不同bait識別序列的雙雜交系統。其采用新型穩定的酵母雙雜交抗生素- 金擔子素Aureobasidin A （AbA）（貨號：M0129），可有效殺死非抗性克隆，從而大大降低背景克隆生長。同時有效縮減假陽性，由于人和prey蛋白單獨將結合引起假陽性都需要識別3個不同序列，激活4個報告基因的表達。
4個報告基因分別是：1個AbA抗生素篩選報告基因，2個營養篩選報告基因，1個藍白斑篩選報告基因。

1）  AUR1-C
AUR1基因的主要突變版，能夠表達肌醇磷脂酰神經酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。當蛋白發生作用促使GAL4轉錄激活，AUR1-C基因進行表達。釀酒酵母中此基因的表達孵育其對高毒抗生素金擔子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景極其低，這一篩選報告子由于單一的營養缺陷報告子。
2）  HIS3
Y2HGold菌株不能合成組氨酸，從而無法在缺少這一必須氨基酸的培養基上生長。當誘餌和誘捕蛋白相互作用，Gal4反應性的His3表達促使細胞合成組氨酸并能在His缺陷培養基上生長。
3）  ADE2
Y2HGold菌株無法在不含腺嘌呤的基本培養基上生長，但當兩個蛋白相互作用，Ade2表達被活化，細胞能在Ade缺陷的基礎培養基上生長。
4）  MEL1
MEL1編碼α-半乳糖苷酶，存在許多酵母菌內的天然表達蛋白。當雙雜交發生，MEL1表達和分泌，在底物X-α-Gal（貨號：M5831-100mg）存在的情況下，酵母菌落變為藍色。

三、三個不同的結合位點（three different binding sites）
Y2HGold菌株三個啟動子控制4個報告基因是不相關的，除UAS區域的短蛋白結合位點特異性結合Gal4 DNA-BD。因此，誘捕蛋白（文庫蛋白或靶蛋白）與UAS內部或邊緣的不相關序列作用（假陽性）就會自動被篩查出來。
 Matchmarker酵母菌株的報告基因構造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C報告基因分別由三個完全異源的Gal4反應啟動元件-G1，G2，M1操控。而啟動子內的蛋白結合位點是不同的，雖然每一個結合位點與Gal4識別的17-mer共有序列相關聯。
酵母雙雜交系統操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）
完整的Matchmarker篩選過程包含以下步驟：
第一步：執行對照實驗；
第二步：誘餌載體的構建及自我激活和毒性檢測；
第三步：篩選Mate&Plate文庫
第四步：確認和闡釋結果
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