Armored CAR-T細胞療法之IL-18的抗癌療效
CAR-T療法作為最有前景的腫瘤治療方式之一，其抗腫瘤效果離不開T細胞的活性及擴增能力等，上一期我們已經介紹關鍵性細胞因子的加入會改善T細胞效力，克服免疫抑制微環境，提高CAR-T療法在液體瘤乃至實體瘤的治療效果。今天我們就繼續介紹這種名為“Armored CAR-T”（裝甲）的細胞療法，和一種新的助力這種CAR-T的明星分子--- 免疫調節因子IL-18。
首先，我們一起了解一下什么是Armored CAR-T？
Armored CAR-T：Armored譯為裝甲，即賦予CAR-T細胞一個裝備使其更加強大。具體是指在第二/第三代CAR-T 的基礎上共表達一些關鍵的細胞因子或共刺激配體，即第四代CAR-T[1]。
意義：不管是血液瘤還是實體瘤，CAR-T細胞活性短、低增殖、抑制腫瘤微環境會抑制T細胞活性，細胞因子或共刺激配體的加入起可以到免疫調節作用，顯著提升T細胞擴增活性和壽命，錦上添花。
舉例： IL-12：系統注射IL-12細胞因子會引起嚴重的炎癥，但共表達IL-12的第四代CAR-T細胞來實現局部表達后，可在腫瘤病灶處招募NK細胞，或者直接逆轉被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環境，并能增強CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒性。如下圖為共表達IL-12的Armored CAR-T可以提高CAR-T功效[1]。
由于目前以共表達細胞因子居多，因此狹義的四代CAR-T即Armored CAR-T可理解為共表達細胞因子，廣義上為表達免疫調節因子，如表達CD40L（TNFR家族的CD40配體）和4-1BBL（共刺激配體），它們可以對抗原遞呈細胞進行額外的共刺激，增強T細胞活性[1]。下圖為表達4-1BBL，共刺激受體4-1BB/4-1BBL可促進T細胞增殖，促使DC細胞活化并分泌細胞因子，并提升細胞溶解能力。
因此，CAR-T設計中加入細胞因子（IL-7，IL-15、IL-18以及IL-21等），可以促進T細胞的增殖活化以及殺傷功能。繼上一期我們已經了解了IL-7的免疫功效，本期就先為大家介紹一下細胞因子IL-18的功能及與腫瘤免疫的關系。
IL-18（interleukin-18，IL18）是近年來發現的一種重要的免疫調節因子，可誘導免疫細胞的增殖并增強其活性，近年來其在抗腫瘤、抗感染以及免疫調節方面的作用更是被廣泛研究，這些都為CAR-T效力的提升以突破傳統局限提供了理論依據和基礎。下面一起來了解一下IL-18的免疫功能吧。
一、 IL-18的發現
IL-18發現于1995年，因可誘導細胞產生IFN-γ，被稱為干擾素誘導因子（IFN-γ Inducing Factor, IGIF），隨后發現其還有促進粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的產生和降低IL-10的產生等功能，被重新命名為IL-18，歸屬于IL-1家族。人和小鼠的IL-18主要由巨噬細胞產生，單核細胞、樹突狀細胞、上皮細胞、成纖維細胞等多種免疫和非免疫細胞也可產生[2]。
二、IL-18信號通路（如下圖）
① 存在于細胞中的IL-18前體，經過加工后釋放到胞外；
② 成熟的IL-18與受體復合物IL-18Rα/IL-18Rβ結合；
③ 最終激活NF-κB轉錄因子，調節基因的轉錄，產生促炎因子。
IL-18主要通過產生IFN-γ來調節免疫細胞的應答，這種調節依賴于IL-12或IL-15，研究表明，在IL-12/15存在時，IL-18可以誘導IFN-γ的產生，而兩者不存在時，則不會誘導或只誘導微量的IFN-γ的產生[3]。
三、IL-18的功能（如下圖[4]）
1. 對T細胞的調節
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進Th1細胞的增殖和分泌大量的IFN-γ，更好地清除抗原，尤其是胞內的細菌、真菌和原生動物；
② 在一些其他刺激信號存在時，IL-18 能誘導原始的或者 Th1 極化的細胞產生Th2 細胞因子如IL-13；
③ IL-18對于Treg細胞也有作用，有研究表明 IL-18 可以有效的抑制 Treg細胞的積累和功能[5]。
2. 對NK細胞的調節
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進NK細胞中IFN-γ 的合成和分泌；
② IL-18 可以通過增加穿孔素perforin ，TNF和 FASL 的表達來增加NK細胞的細胞毒性；
③ 對于自然殺傷性 T 細胞(NKT cells)，IL-18在 IL-12 的協同作用下可以促進自然殺傷性 T 細胞合成 IFN-γ，在 TCR的刺激下 IL-18 可以增強NKT 細胞產生 IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、TNF[6]。
另外嗜堿性粒細胞和肥大細胞也可以在IL-18刺激下產生大量的IL-13，釋放化學調控因子，如組胺等，來保護機體免受外界病原體的干擾。
四、 IL-18的抗腫瘤作用
Micallef在BALB/c小鼠腹腔接種Meth A肉瘤細胞后，腹腔注射或靜脈注射IL-18表現出明顯的抗腫瘤作用。且在接種腫瘤細胞前3h和6h各用1μg的IL-18預處理小鼠一次，接種腫瘤的小鼠均能存活，而對照小鼠在3周內全部死亡。體外試驗表明，IL-18本身沒有抗腫瘤作用，因此其抗腫瘤作用應是通過誘導小鼠體內的NK細胞和細胞毒性細胞而間接發揮的。如下圖為IL-18處理后對NK細胞活性的影響[7]。
IL-18抗腫瘤的機制究竟是如何發生的呢？
① 首先激活NK細胞，分泌大量的IFN-γ，使其能夠特異性地殺傷腫瘤細胞；
② NK細胞的調節下，CD8+T和CD4+T細胞逐漸活化，CTL發揮殺傷作用，并且CD4+T細胞參與腫瘤特異性免疫記憶的形成；
③ 也可通過激活Th細胞產生的細胞因子增強抗腫瘤效果，如分泌的IL-2可以通過激活單核、巨噬細胞增強殺傷活性。
五、 IL-18在腫瘤免疫治療中的應用
上述，介于IL-18在免疫調控中的強大功能，其在腫瘤免疫方面中的應用被廣泛研究，與其他細胞因子相比，IL-18表現出了更強大的抗腫瘤效應，且毒副作用更低。主要包括以下幾方面：
應用1：一項關于腎透明細胞癌的臨床I期研究中[8]，病人被給予不同劑量的rhIL-18（recombinant human IL-18），結果顯示所有病人皆耐受良好，這也提示病人對IL-18的耐受度比IL-12或IL-2高10-1000倍，反應了其低度的優良特性。
應用2：IL-18基因轉染的腫瘤細胞體內致瘤性下降，動物存活期延長，表明IL-18是一種具有抗腫瘤作用的新因子，為臨床腫瘤治療提供了一種新的安全有效的手段。
應用3： Tomura[9]等研究了IL-18對NK細胞體外作用的特點，IL-18單獨與NK細胞共育，只能產生少量IFN-γ，在有IL-12或IL-2存在時，能產生大量的IFN-γ。然而IL-18與IL-12聯合使用具有較強的毒副作用，可使荷瘤小鼠的體重下降、粘膜糜爛、腹瀉等。實驗提示，這種副作用可能是由于IL-18引起的。因此，明確各個因子的組合及劑量調整也是一個重要研究方向。
綜上所述，IL-18作為一種免疫調節因子，可誘導分泌IFN-γ，顯著增強Th1型免疫反應，因此若在CAR-T中裝上細胞因子IL-18，很可能會增強CAR-T療效，同時還可減少CAR-T細胞的使用量及全身給藥的副作用。另一方面，IL-18對于NK細胞的增強效果也為我們今后的CAR-NK提供了新的思路和靶向。本期就到先到這里了，讓我們一起期待IL-18在CAR-T治療上的神奇療效吧！我們下期再見~
參考文獻
1. Yeku O O, Brentjens R J. Armored CAR T-cells: utilizing cytokines and pro-inflammatory ligands to enhance CAR T-cell anti-tumour efficacy[J]. Biochemical Society Transactions, 2016, 44(2): 412-418.
2. Wawrocki, S., et al., Interleukin 18 (IL-18) as a target for immune intervention. Acta Biochim Pol, 2016. 63(1): p. 59-63.
3. Sedimbi, S.K., T. Hagglof, and M.C. Karlsson, IL-18 in inflammatory and autoimmune disease. Cell Mol Life Sci, 2013. 70(24): p. 4795-808.
4. Tsutsui H, Nakanishi K. Immunotherapeutic applications of IL-18[J]. Immunotherapy, 2012, 4(12): 1883-1894.
5. Carroll, R.G., et al., Distinct effects of IL-18 on the engraftment and function of human effector CD8 T cells and regulatory T cells. PLoS One, 2008. 3(9): p. e3289.
6. Uchida, T., et al., IL-18 time-dependently modulates Th1/Th2 cytokine production by ligand-activated NKT cells. Eur J Immunol, 2007. 37(4): p. 966-77.
7. Micallef, M.J., et al., Interleukin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cytotoxic T lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res, 1997. 57(20): p. 4557-63.
8. Robertson, M.J., et al., A dose-escalation study of recombinant human interleukin-18 using two different schedules of administration in patients with cancer. Clin Cancer Res, 2008. 14(11): p. 3462-9.
9. Tomura, M., et al., A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1+ CD3- cells. J Immunol, 1998. 160(10): p. 4738-46.
首先，我們一起了解一下什么是Armored CAR-T？
Armored CAR-T：Armored譯為裝甲，即賦予CAR-T細胞一個裝備使其更加強大。具體是指在第二/第三代CAR-T 的基礎上共表達一些關鍵的細胞因子或共刺激配體，即第四代CAR-T[1]。
意義：不管是血液瘤還是實體瘤，CAR-T細胞活性短、低增殖、抑制腫瘤微環境會抑制T細胞活性，細胞因子或共刺激配體的加入起可以到免疫調節作用，顯著提升T細胞擴增活性和壽命，錦上添花。
舉例： IL-12：系統注射IL-12細胞因子會引起嚴重的炎癥，但共表達IL-12的第四代CAR-T細胞來實現局部表達后，可在腫瘤病灶處招募NK細胞，或者直接逆轉被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環境，并能增強CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒性。如下圖為共表達IL-12的Armored CAR-T可以提高CAR-T功效[1]。
由于目前以共表達細胞因子居多，因此狹義的四代CAR-T即Armored CAR-T可理解為共表達細胞因子，廣義上為表達免疫調節因子，如表達CD40L（TNFR家族的CD40配體）和4-1BBL（共刺激配體），它們可以對抗原遞呈細胞進行額外的共刺激，增強T細胞活性[1]。下圖為表達4-1BBL，共刺激受體4-1BB/4-1BBL可促進T細胞增殖，促使DC細胞活化并分泌細胞因子，并提升細胞溶解能力。
因此，CAR-T設計中加入細胞因子（IL-7，IL-15、IL-18以及IL-21等），可以促進T細胞的增殖活化以及殺傷功能。繼上一期我們已經了解了IL-7的免疫功效，本期就先為大家介紹一下細胞因子IL-18的功能及與腫瘤免疫的關系。
IL-18（interleukin-18，IL18）是近年來發現的一種重要的免疫調節因子，可誘導免疫細胞的增殖并增強其活性，近年來其在抗腫瘤、抗感染以及免疫調節方面的作用更是被廣泛研究，這些都為CAR-T效力的提升以突破傳統局限提供了理論依據和基礎。下面一起來了解一下IL-18的免疫功能吧。
一、 IL-18的發現
IL-18發現于1995年，因可誘導細胞產生IFN-γ，被稱為干擾素誘導因子（IFN-γ Inducing Factor, IGIF），隨后發現其還有促進粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的產生和降低IL-10的產生等功能，被重新命名為IL-18，歸屬于IL-1家族。人和小鼠的IL-18主要由巨噬細胞產生，單核細胞、樹突狀細胞、上皮細胞、成纖維細胞等多種免疫和非免疫細胞也可產生[2]。
二、IL-18信號通路（如下圖）
① 存在于細胞中的IL-18前體，經過加工后釋放到胞外；
② 成熟的IL-18與受體復合物IL-18Rα/IL-18Rβ結合；
③ 最終激活NF-κB轉錄因子，調節基因的轉錄，產生促炎因子。
IL-18主要通過產生IFN-γ來調節免疫細胞的應答，這種調節依賴于IL-12或IL-15，研究表明，在IL-12/15存在時，IL-18可以誘導IFN-γ的產生，而兩者不存在時，則不會誘導或只誘導微量的IFN-γ的產生[3]。
三、IL-18的功能（如下圖[4]）
1. 對T細胞的調節
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進Th1細胞的增殖和分泌大量的IFN-γ，更好地清除抗原，尤其是胞內的細菌、真菌和原生動物；
② 在一些其他刺激信號存在時，IL-18 能誘導原始的或者 Th1 極化的細胞產生Th2 細胞因子如IL-13；
③ IL-18對于Treg細胞也有作用，有研究表明 IL-18 可以有效的抑制 Treg細胞的積累和功能[5]。
2. 對NK細胞的調節
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進NK細胞中IFN-γ 的合成和分泌；
② IL-18 可以通過增加穿孔素perforin ，TNF和 FASL 的表達來增加NK細胞的細胞毒性；
③ 對于自然殺傷性 T 細胞(NKT cells)，IL-18在 IL-12 的協同作用下可以促進自然殺傷性 T 細胞合成 IFN-γ，在 TCR的刺激下 IL-18 可以增強NKT 細胞產生 IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、TNF[6]。
另外嗜堿性粒細胞和肥大細胞也可以在IL-18刺激下產生大量的IL-13，釋放化學調控因子，如組胺等，來保護機體免受外界病原體的干擾。
四、 IL-18的抗腫瘤作用
Micallef在BALB/c小鼠腹腔接種Meth A肉瘤細胞后，腹腔注射或靜脈注射IL-18表現出明顯的抗腫瘤作用。且在接種腫瘤細胞前3h和6h各用1μg的IL-18預處理小鼠一次，接種腫瘤的小鼠均能存活，而對照小鼠在3周內全部死亡。體外試驗表明，IL-18本身沒有抗腫瘤作用，因此其抗腫瘤作用應是通過誘導小鼠體內的NK細胞和細胞毒性細胞而間接發揮的。如下圖為IL-18處理后對NK細胞活性的影響[7]。
IL-18抗腫瘤的機制究竟是如何發生的呢？
① 首先激活NK細胞，分泌大量的IFN-γ，使其能夠特異性地殺傷腫瘤細胞；
② NK細胞的調節下，CD8+T和CD4+T細胞逐漸活化，CTL發揮殺傷作用，并且CD4+T細胞參與腫瘤特異性免疫記憶的形成；
③ 也可通過激活Th細胞產生的細胞因子增強抗腫瘤效果，如分泌的IL-2可以通過激活單核、巨噬細胞增強殺傷活性。
五、 IL-18在腫瘤免疫治療中的應用
上述，介于IL-18在免疫調控中的強大功能，其在腫瘤免疫方面中的應用被廣泛研究，與其他細胞因子相比，IL-18表現出了更強大的抗腫瘤效應，且毒副作用更低。主要包括以下幾方面：
應用1：一項關于腎透明細胞癌的臨床I期研究中[8]，病人被給予不同劑量的rhIL-18（recombinant human IL-18），結果顯示所有病人皆耐受良好，這也提示病人對IL-18的耐受度比IL-12或IL-2高10-1000倍，反應了其低度的優良特性。
應用2：IL-18基因轉染的腫瘤細胞體內致瘤性下降，動物存活期延長，表明IL-18是一種具有抗腫瘤作用的新因子，為臨床腫瘤治療提供了一種新的安全有效的手段。
應用3： Tomura[9]等研究了IL-18對NK細胞體外作用的特點，IL-18單獨與NK細胞共育，只能產生少量IFN-γ，在有IL-12或IL-2存在時，能產生大量的IFN-γ。然而IL-18與IL-12聯合使用具有較強的毒副作用，可使荷瘤小鼠的體重下降、粘膜糜爛、腹瀉等。實驗提示，這種副作用可能是由于IL-18引起的。因此，明確各個因子的組合及劑量調整也是一個重要研究方向。
綜上所述，IL-18作為一種免疫調節因子，可誘導分泌IFN-γ，顯著增強Th1型免疫反應，因此若在CAR-T中裝上細胞因子IL-18，很可能會增強CAR-T療效，同時還可減少CAR-T細胞的使用量及全身給藥的副作用。另一方面，IL-18對于NK細胞的增強效果也為我們今后的CAR-NK提供了新的思路和靶向。本期就到先到這里了，讓我們一起期待IL-18在CAR-T治療上的神奇療效吧！我們下期再見~
參考文獻
1. Yeku O O, Brentjens R J. Armored CAR T-cells: utilizing cytokines and pro-inflammatory ligands to enhance CAR T-cell anti-tumour efficacy[J]. Biochemical Society Transactions, 2016, 44(2): 412-418.
2. Wawrocki, S., et al., Interleukin 18 (IL-18) as a target for immune intervention. Acta Biochim Pol, 2016. 63(1): p. 59-63.
3. Sedimbi, S.K., T. Hagglof, and M.C. Karlsson, IL-18 in inflammatory and autoimmune disease. Cell Mol Life Sci, 2013. 70(24): p. 4795-808.
4. Tsutsui H, Nakanishi K. Immunotherapeutic applications of IL-18[J]. Immunotherapy, 2012, 4(12): 1883-1894.
5. Carroll, R.G., et al., Distinct effects of IL-18 on the engraftment and function of human effector CD8 T cells and regulatory T cells. PLoS One, 2008. 3(9): p. e3289.
6. Uchida, T., et al., IL-18 time-dependently modulates Th1/Th2 cytokine production by ligand-activated NKT cells. Eur J Immunol, 2007. 37(4): p. 966-77.
7. Micallef, M.J., et al., Interleukin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cytotoxic T lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res, 1997. 57(20): p. 4557-63.
8. Robertson, M.J., et al., A dose-escalation study of recombinant human interleukin-18 using two different schedules of administration in patients with cancer. Clin Cancer Res, 2008. 14(11): p. 3462-9.
9. Tomura, M., et al., A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1+ CD3- cells. J Immunol, 1998. 160(10): p. 4738-46.
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