云序客戶再發高分文章，教你如何玩轉tRNA機制研究

文章導讀：
“忽如一夜春風來，千樹萬樹梨花開！”自然界的花花草草在悄無聲息的感受著大自然的變化。隨著全球氣候的變化，環境溫度也在不斷的變化，那么什么是溫度感受器？AET1是tRNA上鳥苷轉移酶，它是水稻高溫條件下正常生長所必需的。本文研究結果表明，tRNAHis鳥苷轉移酶AET1在植物應對高溫環境中發揮著重要作用。

發表期刊：MOLECULAR PLANT
影響因子：10.12
實驗方法：tRNA測序、RIP、RIP qPCR、RNA pull down

1. AET1突變水稻熱敏性
AET1突變水稻在高溫環境下生長時主要呈矮小株，葉片狹窄卷曲，無法產生種子，相反在相對溫和環境下生長時沒有展現其他異常性狀。AET1基因的ORF區第1144個SNP（C突變為T）會引起第382個氨基酸從脯氨酸改變為絲氨酸。預測AET1基因編碼tRNA鳥苷轉移酶，多物種比對結果顯示AET1基因在包含哺乳動物在內的多種真核生物當中都是高度保守的，而第382個氨基酸在大部分雙子葉和單子葉植物中也是高度保守的。遺傳互補分析（genetic complementation test）顯示互補品系以及過表達水稻株都能夠有效的逆轉高溫下AET1突變所造成的異常形狀。CRISPR/Cas9的基因編輯水稻株也可以造成明顯的生長缺陷。控制變量實驗表明溫度是造成這一現象的環境因素，并且AET1基因是水稻對非生物因素敏感的主要原因。進一步觀察可以看到的是，盡管野生型和AET1突變水稻幼苗們沒有明顯的形態學改變，但是超微結構已經有巨大的改變，表明AET1基因對于高溫條件下細胞的增值是必不可少的。所有的形態學觀察和表型實驗都說明AET1在水稻的生長、發育過程中對高溫的應答過程種起到重要作用。

圖1. AET1突變體是熱敏性的

2.AET1對tRNAHis成熟和tRNA表達穩態起重要作用
體外酶活實驗證明AET1編碼的AET1His可以結合到pre-tRNA（tRNAHis前體）并在pre-tRNAHis 5’端添加鳥嘌呤，然而發生了突變的AET1P382S沒有該功能，表明被突變的382位的脯氨酸對于tRNA的鳥嘌呤轉移酶活性是必不可少的。tRNA測序（云序生物提供）結果表明，野生型和AET1突變型水稻株在正常和高溫條件下成熟tRNA的表達水平改變。測序結果表明，正常溫度下AET1突變體和野生型當中的tRNA異形體（isotype）含量相差不大，但是在高溫條件下AET1突變體當中的含量要明顯的高于野生型水稻株，并且高溫條件下頭部5’帶有鳥嘌呤的tRNA在AET1突變體當中有明顯的下降，這些現象都說明常溫下，AET1基因的酶活性在AET1突變體當中沒有太大改變，但高溫下酶功能會明顯喪失。tRNA測序分析可以看到其他類型的tRNA，比如tRNAMet，在AET1突變株當中的tRNAMet有明顯減少，由于tRNAMet和蛋白的翻譯效率相關，所以推測在高溫條件下AET1敲除水稻株的發育缺陷很有可能是因為蛋白翻譯效率低下造成。AET1基因對于tRNA豐度的維持必不可少，AET1的突變足以改變tRNA表達譜，在高溫環境下，AET1介導的tRNA修飾可以改變多個和蛋白翻譯效率相關的tRNA的表達水平。

圖2. AET1突變在體外消除了AET1的活性，并破壞了體內tRNA表達譜

3.AET1、RACK1A、eIF3h在內質網上的相互作用
酵母雙雜交實驗說明兩個和核糖體相關的蛋白RACK1A以及eIF3h都和AET1相互作用。RNA pull down（云序生物可提供）也證明了AET1與RACK1A以及eIF3h結合。通過GST標簽的RACK1A蛋白也能夠富集MBP融合eIF3H。這些結果都能夠進一步證明AET1、RACK1A以及eIF3h三個蛋白能相互結合。生物分子熒光互補實驗證明RACK1A、eIF3h以及AET1三者能持續相互作用，這些結果都證明三個蛋白在體內能直接相互作用。融合蛋白的熒光信號顯示，蛋白的熒光信號和ER（內質網）標志蛋白重疊，暗示三者之間的相互作用發生在內置網上與核糖體相關。GUS染色，qRT-PCR分析AET1，RACK1A以及eIF3h三個基因的mRNA表達量，三個基因在所有的組織當中具有廣泛表達，證明三個蛋白相互作用和廣泛的蛋白合成相關。

    

圖3. AET1與ER中RACK1A和eIF3h相互作用

4.AET1而不是RACK1A以及eIF3h直接和OsARF mRNA結合
AET1與RACK1A以及eIF3h的結合是否和mRNA相關？RIP測序（云序生物提供）幫助研究者快速的明確哪些mRNA能夠和蛋白AET1結合，分析結果顯示高溫條件下545個mRNA分子只在野生型水稻株當中和AET1結合，而僅僅208個mRNA分子只在AET1突變植物當中和AET1蛋白結合，50個基因的mRNA分子在兩個樣本當中均發生結合。KEGG結果顯示高溫條件下野生型水稻株當中和AET1結合的mRNA的來源基因往往和光合作用以及代謝過程相關，而高溫條件下只在AET1突變株當中結合的mRNA往往和氨基酸代謝通路相關。這些結果均顯示AET1的功能喪失可以通過tRNA的表達分布的失衡從而影響蛋白的合成。比較有趣的是，熱圖提示高溫條件下和植物生長素（auxin）相關的基因在野生型和突變型當中有明顯的改變，OsARF基因發生了明顯富集，暗示AET1基因可能是通過改變植物生長素信號通路來應對高溫產生應答反應。
對RIP-seq結果進行進一步驗證，RIP qPCR（云序生物可提供）結果顯示OsARF19基因的上游開放閱讀框（uORF）和下游主要開放閱讀框（mORF）被明顯富集，高溫條件下的野生型和AET1突變型這兩者的富集程度有所區別。之前的報道顯示擬南芥當中，許多OsARF mRNA包含可以依賴eIF3h而抑制翻譯的uORFs，作者推測在OsARFs基因當中的uORFs對mORFs的抑制作用也存在，通過預測，RIP-qPCR的進一步驗證表明OsARF23 mRNA含有獨特的“start-stop”uORF結構，AET1能夠在高溫環境下通過OsARF mRNA來調控auxin信號通路。最終結果證明，是AET1，而不是RACK1A或者eIF3h廣泛的結合OsARF mRNA來調控OsARF mRNA的翻譯過程。

圖4. AET1與生長素響應因子的mRNA結合

5.AET1和RACK1A以及eIF3h共同調控OsARF mRNA的翻譯效率
高溫條件下OsARF19和OsARF23翻譯效率均下降，通過CRISPR/Cas9對RACK1A eIF3h基因進行突變發現，相關基因有明顯下降，植物的生長出現明顯的缺陷，比如高度下降、種子產率低等等問題。AET1、eIF3h、RACK1A蛋白表達水平和mRNA轉錄水平保持一致，結果表明AET1蛋白可以明顯的降低OsARF23蛋白的翻譯效率，同時RACK1A以及eIF3h的敲除均能夠引起OsARF23的表達下降。AET1突變水稻株對于外源性的auxin并不敏感，并且AET1基因使水稻對于高溫有更好的適應能力。

   

圖5. AET1與RACK1A和eIF3h一起調節OsARF mRNA的翻譯效率

總結：
植物是無梗生物，因此進化出許多適應環境溫度變化的策略。在本研究中，作者發現了一種名為AET1的鳥苷酰轉移酶，它可以結合ER(內質網)中的RACK1A和elF3h蛋白，并與OsARF mRNAs緊密結合，從而調控相應的蛋白的翻譯，使水稻對于高溫有更好的適應能力。
 
全文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1674205219301625
 

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