Nature Cell Biology：外泌體LncRNA幫助免疫細胞“叛變”----乳腺癌惡化新機制！
文章導讀：
外泌體是細胞間傳遞信號的媒介，直徑在30-200nm，表面具有磷脂雙分子層，內部具有豐富內含物的小囊泡，其內含物包括miRNA，環狀RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前發表于Nature Cell Biology（影響因子：19）的文章為例，看一看外泌體中LncRNA的功能機制是如何研究的。
本篇文章由中山大學孫逸仙紀念醫院宋爾衛、蘇士成團隊聯合發表，首次揭示了腫瘤相關巨噬細胞（TAM）通過分泌外泌體包裹的LncRNA調控腫瘤細胞糖代謝過程。為了找到外泌體中特有且高表達的LncRNA，本文作者借助外泌體LncRNA測序，對TAM及對照組細胞分泌的外泌體和相關細胞分別進行測序，找到了在外泌體中特異性高表達的LncRNA HISLA。通過外泌體與腫瘤細胞共培養、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通過抑制轉錄因子HIF-1a與PHD2蛋白結合來保證HIF-1a穩定性，即而維持腫瘤細胞有氧狀態在HIF-1a信號的持續激活。反過來，處于顯著無氧糖酵解狀態的腫瘤細胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬細胞可顯著上調巨噬細胞中HISLA表達，從而維持巨噬細胞來源的外泌體中HISLA的高豐度裝載。
外泌體是細胞間傳遞信號的媒介，直徑在30-200nm，表面具有磷脂雙分子層，內部具有豐富內含物的小囊泡，其內含物包括miRNA，環狀RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前發表于Nature Cell Biology（影響因子：19）的文章為例，看一看外泌體中LncRNA的功能機制是如何研究的。
本篇文章由中山大學孫逸仙紀念醫院宋爾衛、蘇士成團隊聯合發表，首次揭示了腫瘤相關巨噬細胞（TAM）通過分泌外泌體包裹的LncRNA調控腫瘤細胞糖代謝過程。為了找到外泌體中特有且高表達的LncRNA，本文作者借助外泌體LncRNA測序，對TAM及對照組細胞分泌的外泌體和相關細胞分別進行測序，找到了在外泌體中特異性高表達的LncRNA HISLA。通過外泌體與腫瘤細胞共培養、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通過抑制轉錄因子HIF-1a與PHD2蛋白結合來保證HIF-1a穩定性，即而維持腫瘤細胞有氧狀態在HIF-1a信號的持續激活。反過來，處于顯著無氧糖酵解狀態的腫瘤細胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬細胞可顯著上調巨噬細胞中HISLA表達，從而維持巨噬細胞來源的外泌體中HISLA的高豐度裝載。
路線圖：
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理解重點：
1.TAM是一種癌癥相關巨噬細胞。在遇到癌癥細胞后，職能發生180度大轉變，成為癌細胞的“幫兇”，參與癌細胞促生長，遷移等過程。目前已發現，TAM中LncRNA能夠以外泌體為媒介參與鄰近癌細胞糖酵解的過程。本文想深入探究其中的機制。本文對照組：外周血中分離的一種單核巨噬細胞（MDM）。
2. HIF-1α是一種氧傳感轉錄因子，能夠決定葡萄糖的代謝途徑是氧化還是糖酵解（無氧）。HIF-1α首先被PHD2羥基化，然后被降解。在本文中發現，LncRNA HISLA競爭性與PHD2結合，從而防止HIF-1α降解，達到增強腫瘤細胞有氧糖酵解。
3. 葡萄糖作為能量代謝的原料，主要通過有氧或無氧（又叫糖酵解）方式代謝產能。而腫瘤細胞在有氧條件下發生的糖酵解，產生大量中間產物：乳酸。
1.TAM是一種癌癥相關巨噬細胞。在遇到癌癥細胞后，職能發生180度大轉變，成為癌細胞的“幫兇”，參與癌細胞促生長，遷移等過程。目前已發現，TAM中LncRNA能夠以外泌體為媒介參與鄰近癌細胞糖酵解的過程。本文想深入探究其中的機制。本文對照組：外周血中分離的一種單核巨噬細胞（MDM）。
2. HIF-1α是一種氧傳感轉錄因子，能夠決定葡萄糖的代謝途徑是氧化還是糖酵解（無氧）。HIF-1α首先被PHD2羥基化，然后被降解。在本文中發現，LncRNA HISLA競爭性與PHD2結合，從而防止HIF-1α降解，達到增強腫瘤細胞有氧糖酵解。
3. 葡萄糖作為能量代謝的原料，主要通過有氧或無氧（又叫糖酵解）方式代謝產能。而腫瘤細胞在有氧條件下發生的糖酵解，產生大量中間產物：乳酸。
正文部分：
1.TAM促進有氧糖酵解和抑制乳腺癌細胞凋亡過程
借助免疫組化，通過GLUT3和CD63抗體標記乳腺癌組織，發現糖酵解與TAM相關。為了實驗準確性，將每組8例樣本量擴大到453例，從而得到了同樣趨勢，說明TAM與有氧糖酵解存在很大聯系。通過體外共培養實驗，進一步研究TAM調控腫瘤有氧糖酵解過程機理，發現乳腺癌細胞與從組織中分離的原代TAM共培養后，能夠顯著提高糖酵解水平（檢測指標包括：細胞外酸化程度，葡萄糖消耗量和乳酸量，糖酵解途徑蛋白marker）。同時，發生有氧糖酵解細胞的凋亡能力往往很低。 
2.TAM激活HIF-1α參與促進有氧糖酵解和抑制細胞凋亡
已有研究報道HIF-1α可促進有氧糖酵解過程。作者將乳腺癌細胞與TAM共培養后，發現HIF-1α蛋白高表達，并且找到了高表達的原因在于其半衰期很長。同時，HIF-1α與有氧糖酵解水平呈正比（檢測指標同一）。并且，HIF-1α抑制細胞凋亡。
已有研究報道HIF-1α可促進有氧糖酵解過程。作者將乳腺癌細胞與TAM共培養后，發現HIF-1α蛋白高表達，并且找到了高表達的原因在于其半衰期很長。同時，HIF-1α與有氧糖酵解水平呈正比（檢測指標同一）。并且，HIF-1α抑制細胞凋亡。
3. 高通量測序篩選在TAM外泌體中高表達LncRNA
TAM主要研究領域是它們與其他類型細胞間傳遞遺傳信息的機制，那外泌體是否是其中的媒介呢？為了解決這個問題，本文對乳腺癌細胞上清提取的外泌體進行了LncRNA高通量測序，測序組別為三組，分別是TAM與MDM（TAM的對照組細胞）提取的巨噬細胞，TAM與MDM細胞上清提取的外泌體，乳腺癌細胞與TAM共培養細胞與未做處理乳腺癌細胞（對照組）。在TAM外泌體組中找到88個與MDM外泌體相比差異上調的LncRNA。一切高通量手段都要通過低通量手段驗證，作者借助LncRNA定量PCR檢測了7個指標，其中有5個指標與測序結果一致。
TAM主要研究領域是它們與其他類型細胞間傳遞遺傳信息的機制，那外泌體是否是其中的媒介呢？為了解決這個問題，本文對乳腺癌細胞上清提取的外泌體進行了LncRNA高通量測序，測序組別為三組，分別是TAM與MDM（TAM的對照組細胞）提取的巨噬細胞，TAM與MDM細胞上清提取的外泌體，乳腺癌細胞與TAM共培養細胞與未做處理乳腺癌細胞（對照組）。在TAM外泌體組中找到88個與MDM外泌體相比差異上調的LncRNA。一切高通量手段都要通過低通量手段驗證，作者借助LncRNA定量PCR檢測了7個指標，其中有5個指標與測序結果一致。
4. TAM外泌體中LncRNA HISLA促進糖酵解
通過前期高通量測序，找到在三組中都高表達的LncRNA HISLA。將其敲除后，促進了外泌體的分泌。更有趣的是，在與TAM共培養前，抑制乳腺癌細胞中LncRNA HISLA基因能夠抑制糖酵解。并通過RNA聚合酶II和III特異性抑制劑：α-amanitin證實，TAM外泌體未影響腫瘤細胞本身LncRNA轉錄過程，所以受體細胞中LncRNA HISLA增加主要是由于TAM外泌體中帶來的。為了觀察外泌體中LncRNA HISLA的形成軌跡，作者在基因上加上生物素標簽，通過動態共聚焦顯微鏡發現LncRNA HISLA主要由核內體RAB7分泌而來。
通過前期高通量測序，找到在三組中都高表達的LncRNA HISLA。將其敲除后，促進了外泌體的分泌。更有趣的是，在與TAM共培養前，抑制乳腺癌細胞中LncRNA HISLA基因能夠抑制糖酵解。并通過RNA聚合酶II和III特異性抑制劑：α-amanitin證實，TAM外泌體未影響腫瘤細胞本身LncRNA轉錄過程，所以受體細胞中LncRNA HISLA增加主要是由于TAM外泌體中帶來的。為了觀察外泌體中LncRNA HISLA的形成軌跡，作者在基因上加上生物素標簽，通過動態共聚焦顯微鏡發現LncRNA HISLA主要由核內體RAB7分泌而來。
5.腫瘤缺氧微環境中乳酸在TAM中上調LncRNA
通過生信軟件預測LncRNA HISLA基因啟動子區域與轉錄因子PU.1有典型結合位點。接著，借助ChIP qPCR實驗證實兩者是直接結合的。作者又發現LncRNA HISLA在TAM中的表達量遠高于其他巨噬細胞MDM，已有研究表明MDM“策反”為TAM細胞期間，細胞中性粒細胞集落刺激因子和乳酸會差異表達，檢測后發現導致LncRNA HISLA上調的主要原因是乳酸。更有趣的是，作者在TAM中發現HIF-1α表達量與LncRNA HISLA相關，并且LncRNA HISLA能夠影響有氧糖酵解的生理表型。總的來說，乳酸在腫瘤缺氧微環境中起正反饋作用。
通過生信軟件預測LncRNA HISLA基因啟動子區域與轉錄因子PU.1有典型結合位點。接著，借助ChIP qPCR實驗證實兩者是直接結合的。作者又發現LncRNA HISLA在TAM中的表達量遠高于其他巨噬細胞MDM，已有研究表明MDM“策反”為TAM細胞期間，細胞中性粒細胞集落刺激因子和乳酸會差異表達，檢測后發現導致LncRNA HISLA上調的主要原因是乳酸。更有趣的是，作者在TAM中發現HIF-1α表達量與LncRNA HISLA相關，并且LncRNA HISLA能夠影響有氧糖酵解的生理表型。總的來說，乳酸在腫瘤缺氧微環境中起正反饋作用。
6. HISLA通過干擾PHD2與HIF-1α結合從而維持HIF-1α穩定
當乳腺癌細胞與TAM或TAM外泌體共培養時，細胞的羥甲基化和退化都收到了抑制，而此過程可能與HIF-1α的羥甲基化和退化有關。RNA pull down和RIP實驗證實LncRNA HISLA與PHD2（HIF-1α的羥甲基化和退化指示蛋白）是直接結合的關系。Fish實驗證實兩者主要結合在細胞質。
當乳腺癌細胞與TAM或TAM外泌體共培養時，細胞的羥甲基化和退化都收到了抑制，而此過程可能與HIF-1α的羥甲基化和退化有關。RNA pull down和RIP實驗證實LncRNA HISLA與PHD2（HIF-1α的羥甲基化和退化指示蛋白）是直接結合的關系。Fish實驗證實兩者主要結合在細胞質。
7. LncRNA HISLA與乳腺癌糖代謝和化療耐受相關
為驗證本次研究成果與臨床的相關性，作者以453個乳腺癌患者為樣本，檢測LncRNA HISLA表達量與腫瘤糖代謝關鍵基因（GLUT1，GLUT3，HK2）以及TAM的marker：CD68抗原。結果顯示LncRNA HISLA在TAM中廣泛表達，檢出率為33%，同時表達量與TAM的浸潤面積相關。重要的是，LncRNA HISLA在患者血液外泌體和組織樣本中表達量相關，且都與TAM相關。表明在乳腺患者體內的TAM通過抑制LncRNA HISLA表達，從而增強腫瘤糖酵解過程。另外，作者將LncRNA HISLA表達情況與臨床病理關聯，發現高表達組與疾病的分級、分期、淋巴結轉移及HER2亞型相關。并且表達量與GLUT3高表達，患者較差生存情況相關。總的來說，LncRNA HISLA在乳腺癌化療耐藥方面可作為理想的分子標志物。
為驗證本次研究成果與臨床的相關性，作者以453個乳腺癌患者為樣本，檢測LncRNA HISLA表達量與腫瘤糖代謝關鍵基因（GLUT1，GLUT3，HK2）以及TAM的marker：CD68抗原。結果顯示LncRNA HISLA在TAM中廣泛表達，檢出率為33%，同時表達量與TAM的浸潤面積相關。重要的是，LncRNA HISLA在患者血液外泌體和組織樣本中表達量相關，且都與TAM相關。表明在乳腺患者體內的TAM通過抑制LncRNA HISLA表達，從而增強腫瘤糖酵解過程。另外，作者將LncRNA HISLA表達情況與臨床病理關聯，發現高表達組與疾病的分級、分期、淋巴結轉移及HER2亞型相關。并且表達量與GLUT3高表達，患者較差生存情況相關。總的來說，LncRNA HISLA在乳腺癌化療耐藥方面可作為理想的分子標志物。
總結：
本文首先通過外泌體LncRNA測序證實TAM通過分泌外泌體中LncRNA促進乳腺癌細胞糖酵解過程。借助分子間相互作用的機制實驗，如RNA Pull Down，RIP，ChIP等證實LncRNA HISLA可通過結合PHD2蛋白從而維持HIF-1α穩定。同時，癌細胞分泌乳酸對TAM中LncRNA HISLA具有上調作用，從而形成了正反饋。臨床大樣本數據結果證實LncRNA HISLA在TAM中表達，并且與乳腺癌患者糖酵解、化療效果差異和生存期長短相關。總的來說，本研究發現了腫瘤細胞分泌細胞外囊泡所攜帶LncRNA具有促進腫瘤糖酵解作用。
全文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41556-019-0299-0
https://doi.org/10.1038/s41556-019-0299-0
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