Hepatology：m6A RNA甲基化酶METTL3促肝癌發展新玄機

導讀

近年來，m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域最前沿最熱門的研究方向之一，不斷有CNS的文章問世，m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰，而人們更關心的似乎是m6A RNA修飾與重大疾病例如腫瘤之間的相關性。表觀遺傳的改變極大得促進了人類癌癥的發展，近期Hepatology的一篇題為“RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2” 文章報道了m6A修飾在肝癌中的作用。

在本研究中，作者通過轉錄組測序發現m6A甲基化酶METTL3在人肝癌及其它惡性腫瘤中顯著上調，并且其過表達預示著較差的臨床預后。體外實驗表明METTL3可促進肝癌細胞的增殖，侵襲和克隆形成。體內實驗也表明METTL3可促進肝癌成瘤能力和肺侵襲能力。接下來，通過比較轉錄組測序，m6A測序及MeRIP-qPCR結果作者發現SOCS2可作為METTL3介導的m6A修飾的靶基因。敲除METTL3可破壞SOCS2的RNA甲基化水平，并上調其mRNA表達水平。作者還發現m6A介導的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A讀取蛋白YTHDF2的。本研究為肝癌表觀水平改變的研究提供了新的維度。

1.m6A甲基化酶METTL3在肝癌中表達上調，并預示著較差的臨床預后 

通過對16對HBV相關的肝癌和對應的非癌癥組織進行RNAseq，作者發現m6A甲基化轉移酶核心成分METTL3顯著上調，這一結果與TCGA數據庫中50對肝癌患者的數據一致。接下來，作者在104對肝癌和正常肝組織中進行qPCR驗證，發現和測序結果一致，METTL3都顯著上調，并且其m6A水平也是顯著高表達的。此外，高表達的METTL3與較差的預后顯著相關，這提示我們METTL3在肝癌中的上調有可能促進肝癌的發生發展。

圖示：METTL3在肝癌中的表達及其與生存力的關系

2.METTL3促進肝癌的發生發展 

作者通過shMETTL3#1和shMETTL3#2穩定敲低HepG2和Huh-7細胞的METTL3，體外實驗表明敲低METTL3可抑制肝癌細胞的增殖，克隆形成及侵襲作用。此外，通過皮下接瘤實驗發現敲除METTL3可抑制成瘤能力和生長速率。另外，作者還通過CRISPR/dCas9-VP64/MS2-p65-HSF1基因激活系統過表達MHCC97L細胞的內源性METTL3，發現METTL3過表達可促進肝癌的增殖和侵襲。綜上所述，METTL3可促進肝癌的發生發展。

圖示：敲低METTL3可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲

圖示：敲低/除METTL3可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲

圖示：過表達METTL3可促進肝癌的發生發展

3.RNA-seq和m6A-seq共同鑒定SOCS2是METTL3介導的m6A修飾下游的靶基因  

接下來，通過比較轉錄組測序，m6A測序及MeRIP-qPCR結果作者發現SOCS2可作為METTL3介導的m6A修飾的下游靶基因。 

圖示：RNA-seq和m6A-seq共同鑒定SOCS2是METTL3介導的m6A修飾下游的靶基因

4.METTL3通過m6A閱讀器YTHDF2依賴的通路抑制SOCS2的mRNA穩定性

作者首先通過MeRIP-qPCR證實了SOCS2的mRNA受到METTL3的m6A修飾調控。為了探究m6A修飾是如何影響SOCS2表達的，作者構建了野生型和突變型SOCS報告mini基因。對于突變報告mini基因而言，m6A的共有序列（比如RRACH）中A被替換成C,從而消除m6A修飾。作者發現突變了SOCS2后顯著增加了SOCS2的表達，通過比對熒光活性，還發現在野生型的SOCS2融合人報告基因的熒光強度在沉默METTL3后被顯著放大。然而，敲低METTL3對突變型的SOCS2融合報告基因沒有影響。以上結果表明SOCS2的表達水平是由METTL3的m6A修飾調控的。另外，從測序結果中作者發現YTHDF2結合位點與m6A修飾位點很接近。因此作者通過敲低YTHDF2，結果發現SOCS2表達顯著上調。上述結果都再次證實METTL3通過m6A閱讀器YTHDF2依賴的通路抑制SOCS2的mRNA穩定性。

圖示：SOCS2表觀沉默是通過METTL3-m6A-YTHDF2依賴的機制實現的

5.SOCS2抑制肝癌的發展

本研究到這，已經發現METTL3敲除可增加SOCS2的mRNA和蛋白表達，因此作者對上述的102對肝癌組織和相應的正常肝組織進行qPCR，發現SOCS2在肝癌細胞中顯著下調，且其中88.2%下調倍數大于2。通過體外實驗驗證，作者發現SOCS2可已知肝癌的發生發展。結合TCGA數據庫，發現SOCS2與METTL3表達負相關。綜上所述，SOCS2是METTL3下游的靶基因，在肝癌中發揮抑制作用。

圖示：SOCS2作為腫瘤抑制基因，與METTL3表達負相關

參考文獻：RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2