ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)分享

  染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱ChIP）是研究活體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組DNA結(jié)合的狀況。隨著對(duì)基因功能研究的不斷深入，這項(xiàng)技術(shù)正越來(lái)越多的被應(yīng)用于科研的各個(gè)領(lǐng)域。

ChIP的原理

  把生理狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)，然后可進(jìn)行后續(xù)的DNA序列測(cè)序鑒定等。

ChIP實(shí)驗(yàn)步驟

ChIP經(jīng)驗(yàn)分享

ChIP實(shí)驗(yàn)操作性很強(qiáng)，金開(kāi)瑞根據(jù)多年的實(shí)踐，總結(jié)了一些ChIP實(shí)驗(yàn)中您可能會(huì)遇到的棘手的問(wèn)題，下面我們就一起來(lái)分享一下吧！                                                 

細(xì)胞固定

1、甲醛終濃度為1%較適宜；

2、固定時(shí)間一般為5-60min較好，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。；

染色質(zhì)斷裂

超聲時(shí)斷時(shí)續(xù)，保證低溫；
注意探頭位置，防止產(chǎn)生泡沫；
研究組蛋白需使用酶處理；

染色質(zhì)免疫沉淀

最好有Input對(duì)照，Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟。

抗體的選擇是關(guān)鍵。抗體的選擇要注意三點(diǎn)：一是應(yīng)該選擇能夠做ChIP實(shí)驗(yàn)的抗體。盡量選擇ChIP級(jí)別商業(yè)化的抗體。如沒(méi)有，一般可以重組到帶有標(biāo)簽的載體上，再轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主（目前市面上商業(yè)化的chip抗體只有300多種，因此正好找到對(duì)應(yīng)抗體較困難，可以選擇標(biāo)簽抗體）。二是抗體的結(jié)合位點(diǎn)。選擇單抗的話，盡量遠(yuǎn)離抗原和染色質(zhì)相結(jié)合的位點(diǎn)，這樣可以最大限度保證抗體和抗原的結(jié)合，而多抗可識(shí)別多個(gè)表位，可基本避免該風(fēng)險(xiǎn)。因此單多抗各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注該抗體是否經(jīng)過(guò)ChIP驗(yàn)證。三是抗體的濃度。抗體濃度的也很重要，濃度太低，不能與靶蛋白完全結(jié)合。濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性條帶增加背景。

陰性對(duì)照可以使用血清或lgG，陽(yáng)性對(duì)照一般使用RNA Polymerase II或者組蛋白。

陰性對(duì)照：用實(shí)驗(yàn)抗體同型的IgG作為抗體，理論上不會(huì)ChIP下來(lái)任何DNA片段，因此作為陰性對(duì)照，但是由于非特異結(jié)合，或者實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)發(fā)生結(jié)合的DNA清除不完全，可能也會(huì)出現(xiàn)條帶。如果陰性對(duì)照樣品中的產(chǎn)物量等于特異靶標(biāo)樣品中產(chǎn)物量，說(shuō)明特異靶標(biāo)抗體未發(fā)揮作用或者染色質(zhì)斷裂不充分。

陽(yáng)性對(duì)照：為了保證陽(yáng)性對(duì)照有效，一般選擇陽(yáng)性對(duì)照的引物是根據(jù)管家基因設(shè)計(jì)的。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3（組蛋白）抗體，因?yàn)镽NA Polymerase II是通用轉(zhuǎn)錄因子，在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。因此，理論上ChIP后PCR都會(huì)有條帶。

需設(shè)計(jì)已經(jīng)確定的、不與特異抗原相結(jié)合的DNA片段的引物，用來(lái)排除抗原和染色質(zhì)的非特異結(jié)合。

交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)

RNA酶、蛋白酶需65℃保溫6小時(shí)
不加蛋白酶可以提取、分析結(jié)合蛋白

DNA的純化

最好用試劑盒，便于后面的PCR檢測(cè)

DNA的鑒定

1、可以進(jìn)行二代測(cè)序或者QPCR檢測(cè)結(jié)果

  因?yàn)镃hIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程的每一步都應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)的對(duì)照，而且對(duì)結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。如果ChIP實(shí)驗(yàn)方面有什么問(wèn)題，歡迎與我們交流哦！