BioTNT mRNA 引物篩選，引物定制或specific primers的使用說明書
版本號：20100001
BioTNT qPCR Primer Assay for specific mRNA genes
目錄號：SER-PCR –編號（500T）;
說明書 Part A
一、產品簡介：
本試劑盒是基于最可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR試劑盒并應用基因表達分析。
我們的實驗為基因特異性定量PCR驗證具有統一、高效和標準化特點的擴增反應條件。
每一對引物都是經過嚴格的實驗驗證的。
已經使用適當的real time PCR Mix的時候，合適的片段大小和高的擴增效率成為保證。
qRT-PCR Primer pair kits統一的擴增效率和條件為熒光定量pcr實驗中多基因表達的檢測提供了準確而靈活的解決方案。
完整的試劑盒說明書由part A 和Part B構成。Part A 主要描述了本試劑盒的使用方法和注意事項，Part B主要注明了assay 的特異情況。
二、產品特點：
本產品適用于有一定q PCR實驗經驗的客戶或者無經驗的客戶在公司的技術指導下進行。
三、保存條件：
可在常溫下運輸。常期保存請在-20℃保存，效期12個月。
警告：本產品僅供科研使用，請勿用于醫藥、臨床治療、食品及化妝品等其他用途。
安全提示：本產品中部分試劑有腐蝕性或毒性，請勿直接接觸皮膚或吞咽；操作時請穿戴實驗服、防護鏡和手套；如果接觸皮膚，應立即用洗滌劑和大量清水沖洗；誤食或其他危急情況，請及時到醫院就治；部分試劑易燃，請注意消防安全。
四、注意事項：
請在收到此試劑盒后立刻檢查試劑盒組成，BioTNT 公司只負責受理在試劑盒簽收后三個工作日內的試劑缺失報告；
五、試劑盒組成：
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試 劑
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說 明
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T
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qPCR上游引物
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10×
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1ml （500T）
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qPCR下游引物
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10×
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1ml （500T）
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其他特點請參照Part B。
六、保證結果可使用的qPCR試劑：
BioTNT real time PCR Premix 貨號：A2010A0112
七、其他需要自己準備的：
1、 耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（無菌、無酶、RNase-free；貨號），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的槍頭；）；
2、 檢測的樣本CDNA；
3、 無菌無酶的 PCR 水（貨號：A2010B0X03）；
4、 離心機；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；
5、 手套，口罩。
八、預防RNase污染，應注意以下幾個方面：
1、 經常更換新手套，以防止RNase污染；
2、 使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染；
3、 RNA在Rrizol試劑中時短時間內不會被RNase降解，但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料或玻璃器皿（玻璃器皿可在150℃燒烤4小時，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase）；
4、 配制溶液應使用RNase-free ddH2O（貨號：A2010B0X03）
九、操作步驟：
1、 請混勻所有的試劑（15秒）；
2、 請按以下配比對每個反應配20μL的體系：
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反應液組份
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用于熒光PCR實驗
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加量 (μL)
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終濃度
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備注
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Real time PCR Premix試劑混合物
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10
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1×
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貨號：
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上游引物（10×）
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2
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1×
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下游引物（10×）
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2
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1×
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待檢DNA樣品
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1
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用戶提供*
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PCR水
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5
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總體積
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20
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*注意：如果您的cDNA模板不是使用BioTNT的cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號：A2010B0B01，A2010B0B02）進行逆轉錄合成的，請適當的調整cDNA的用量（1-6μL），調整無菌去離子水的用量，使總體積保持20μL；
*注意：如果您不使用BioTNT real time PCR Premix，請做引物濃度梯度實驗，以使實驗達到最佳效果；
*注意：建議MIX引物、標本與PCR水預混，在實驗操作中盡量避免使用移液器的最小量程，盡量減少加樣次數，以減少因加樣而導致的誤差。在操作中，應使用不含熒光物質的一次性手套(經常替換)、移液器頭(帶濾嘴自卸式)，不能用手直接觸摸PCR反應管/條/板。
*注意：如果使用其他體積的體系（5-50μl），應保證終濃度與說明書上的終濃度一致。配制反應體系時，應注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，避免產生氣泡。如果產生氣泡，請用手指將氣泡彈破，再低速離心。反應體系配制完畢后低速離心數秒，立即進行PCR擴增。
*大多數儀器建議采用20ul體系；Roche的lightcycler 和ABI 7900，stepone plus，viia7 等可以采用10ul體系；
*建議每個樣本同一個基因做雙重復或者三重復；
*設立陰性對照(即加樣品的時候用水來代替);
*建議購買BioTNT 的陽性對照( 貨號: A2010B0X10 ); 并在實驗中設立陽性對照;
1、 低速離心數秒，并且按照熒光PCR儀的使用說明放置好您的PCR管/條/板；
2、 從下列表中選擇最合適的實驗反應條件，按照熒光PCR儀的使用說明設置好PCR反應條件：
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熒光PCR儀
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循 環
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時 間
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溫 度
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ABI: 5700, 7000, 7300, 7500, 7700, 7900HT, StepOnePlus
BioRad: iCycler®, iQ5, MyIQ
Stratagene: Mx3000p, Mx3005p, Mx4000p
Eppendorf: Mastercycler® ep realplex
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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40
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15 seconds
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95℃
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1 minute [2]
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60℃
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Roche*: LightCycler 480®
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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45
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15 seconds
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95℃
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1 minute [2]
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60℃
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*注意羅氏LightCycler 480 ®用戶：請調整升溫速率為1℃/秒。更多關于其他所需的改變和熔融曲線設置的信息請參閱儀器安裝指南。
3、下列儀器使用三個步驟的循環程序：
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熒光PCR儀
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循 環
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時 間
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溫 度
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BioRad: CFX96, CFX384, Opticon,
Opticon 2, Chromo 4 (MJ Research)
Takara: TP-800
All other instruments
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1
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5 minutes [1]
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95℃
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40
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15 seconds
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95℃
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20 到30 seconds
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60℃
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30 seconds [2、3]
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72℃
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[1]95℃ 5分鐘的步驟是為了激活熱啟動DNA聚合酶。
[2]檢測并記錄熒光染料熒光信號在每個周期的延伸結束時。
[3]不同的儀器需要檢測熒光信號的時間長短不同，請根據您的儀器選擇適當的延伸時間。
反應條件示例：95℃ 5分鐘→95℃ 15秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線分析；
40個循環
注：以上反應條件是應用BioTNT 染料法premix（貨號：A2010A0112），在ABI stepone plus上的反應條件。請注意，第一步95℃ 5分鐘 是BioTNT premix的hot start的特點，如使用其他公司的premix，請調整這一步的反應時間。
十、實驗結果判斷:
i.陽性對照(或者客戶的陽性模板)的內參基因的熔解曲線呈單峰，其Tm與引物說明書上的產物Tm相近；擴增曲線呈S型； 雙重復重復良好（Ct值相差不超過1），說明加樣誤差和儀器誤差比較小，可用；如果 CT相差超過1.5，該數據不可用，需要重新檢測；
ii.陰性孔Ct＞33，熔解曲線在目的產物或內參產物峰處無明顯特異性產物峰出現，說明實驗體系無污染，數據可信；
iii.內參實驗的CT值在15-25之間，可根據文獻來確定內參基因CT應該在的區域，來進行數據判斷，抽提和逆轉錄的可靠性；
iv.其他情況請參考實驗疑難分析與解答或咨詢公司技術人員。
十一：內參基因的選擇：
1、對照組和實驗組的內參基因，盡量少受實驗干預的影響；可以進行多個內參基因的比較，選擇較少受實驗干預影響的內參基因；
2、請選擇與目的基因CT比較接近的內參基因，來作為實驗的內參基因，進行均一化處理。
十二、Trouble shooting
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問題
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解決
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樣本沒有擴增曲線
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查看儀器設置，是否設置正確的熒光讀板時間，不同機器有不同的讀板方式；即使沒有擴增，也會有熒光檢測曲線；ABI 機器在部分錯誤設置時，不能顯示正確的擴增曲線；ABI機器可以查看儀器的原始熒光信號；
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樣本沒有熔解曲線
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查看熔解曲線設置是否正確；
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雜亂的熔解曲線
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可能沒有產物；查看BioTNT microRNA assay提供的陽性CDNA對照進行real time PCR 擴增結果如何；
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熔解曲線峰與BioTNT microRNA assay 中提供的tm 值不一致
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與公司的技術部聯系
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陰性對照有擴增曲線，且熔解曲線峰與目的產物峰相同
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被污染，注意加樣和PCR的防污染措施
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相關的產品：
1、 Trizol法總RNA提取試劑盒，貨號： A2010B0A01（20T）， A2010B0A02（50T），A2010B0A03（100T）；
2、 cDNA第一鏈合成試劑盒，貨號：A2010B0B01（50T），A2010B0B02（100T）；
3、 real time PCR Premix試劑盒，貨號： A2010A0112；
4、 目的基因陽性對照，貨號：A2010B0X10；
5、 內參基因real time PCR primer pairs，貨號：A2010AH001 （500T）; A2010AM001 （500T）; A2010AR001 （500T）；
品質保證：
所有產品由BioTNT 進行品質保證。
如果客戶使用中有任何問題，都可以聯系BioTNT公司。
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